论文摘要
鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地。感染鸡的艾美耳属球虫中,国外已报道在巨型艾美耳球虫（E.maxima）,堆型艾美耳球虫（E.acervulina）,毒害艾美耳球虫（E.necatrix）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）中发现了病毒粒子或病毒RNA。但是作为危害最严重的柔嫩艾美耳球虫是否有病毒感染,国内外迄今尚无报道。本研究首次在柔嫩艾美耳球虫中发现病毒并对其进行了鉴定,同时对该病毒在虫体不同发育阶段细胞内分布进行了观察。携病毒柔嫩艾美耳球虫虫株分离筛选:本研究从临床上感染柔嫩艾美耳球虫的鸡盲肠分离柔嫩艾美耳球虫卵囊,孢子化后进行扩增,然后通过提取孢子化卵囊总核酸进行电泳来筛选含病毒的虫株。总核酸电泳结果表明,除虫体基因组外,观察到大小分别为1.4kb、2.4kb和3.6kb的三条核酸带,初步获得一株携病毒的柔嫩艾美耳球虫株。将携病毒虫株采用单卵囊接种技术进一步分离纯化,采用种特异引物RT-PCR和虫体总核酸电泳再次鉴定后分离纯种的携病毒柔嫩艾美耳球虫。结果表明获得了两株纯种的携病毒柔嫩艾美耳球虫。柔嫩艾美耳球虫病毒的鉴定:通过核酸分析、RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和电镜形态观察对病毒进行鉴定。核酸酶的敏感性试验结果表明在柔嫩艾美耳球虫总核酸电泳图谱上观察到的大小分别为1.4kb、2.4kb和3.6kb的三条病毒带均不能被DNA酶（100μg/mL）降解,但可被RNA酶（1.0μg/mL）降解,表明这些核酸为RNA。另外,这些核酸不能被高盐浓度（0.3 M NaCl） RNase A（10μg/mL）降解,但可被低盐浓度（0.015 M NaCl） RNase A（10μg/mL）降解,并且采用α-32P标记的UTP掺入法测得该病毒样核酸具有RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）活性,表明这些核酸为双链RNA（dsRNA）。利用蔗糖梯度离心和透射电镜技术对柔嫩艾美耳球虫病毒进行了分离和鉴定。电镜负染观察到柔嫩艾美耳球虫病毒粒子外观呈球形,二十面体,无囊膜,直径38nm。。柔嫩艾美耳球虫病毒细胞内分布:通过柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体的电镜观察和总核酸分析,观察到病毒核酸存在于柔嫩艾美耳球虫生活史的孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖的全过程中。另外内生性发育时期病毒释放观察在盲肠上皮细胞中没有发现病毒RNA。电镜观察柔嫩艾美耳球虫病毒粒子只存在于孢子生殖这一个阶段。通过超声破碎孢子化卵囊,差速离心后提取不同组份的总核酸分析,结果发现病毒粒子定位于子孢子的细胞质中。裂殖子和配殖子的超薄切片中未发现病毒粒子,表明裂殖生殖和配子生殖这两个阶段中未包装成病毒粒子。柔嫩艾美耳球虫病毒的发现丰富了原虫病毒的研究,是柔嫩艾美耳球虫研究的潜在基因转染载体,必将对柔嫩艾美耳球虫病的防治研究具有特别重要的意义。
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标签：柔嫩艾美耳球虫论文; 柔嫩艾美耳球虫病毒论文; 鉴定论文; 细胞内分布论文;