二步发酵法中两种转化菌营养生理的研究

论文摘要

维生素C又叫L-抗坏血酸,是一类水溶性呈酸性的维生素,具有重要的生理功能,用途十分广泛。当前,我国维生素C产量占世界总产量的90 %以上,其中出口量达到80%以上。国内大规模生产工艺以“二步发酵法”为主,即首先通过生黑醋酸杆菌（Acetobacter melanogenumr）将D-山梨醇氧化成L-山梨糖,这个过程被称为第一步发酵,然后再经过混合菌发酵将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸,此过程被称为第二步发酵,最后2-酮基-L-古龙酸再经过化学内酯化生成维生素C,其中,在第二步发酵中,发酵过程是由两株不同菌完成的,一株例如为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium业内称大菌）,另一株为普通生酮基古龙酸菌（Ketogulonigenium vulgare业内称小菌）大小菌混合培养能够转化90 %以上的山梨糖,生成2-酮基-L-古龙酸,目前大小菌之间的生理关系在理论上依然不是很清楚。本研究的重点在探究第一步发酵中的醋酸菌和第二步发酵中的小菌这两种氧化菌对营养底物的氧化性,并在此基础上进一步研究了第二步发酵过程中小菌单独生长的营养因子,探究了混合菌之间的内在联系。主要研究结果如下:（1）创建了能够快速准确筛选转化底物的筛选模型,结果表明醋酸菌AS1.114和生酮古龙酸菌都能够快速转化甘露醇、丙三醇、葡萄糖、果糖、木糖、乙醇、和山梨醇生成对应的醛或酸,但醋酸菌AS1.114不能转化山梨糖;生酮古龙酸菌虽然能够转化山梨糖生成2-酮基-古龙酸,但速度较其它底物慢,因此不是生长的最佳营养物;（2）验证了醋酸菌AS1.114能够有效转化山梨醇形成山梨糖,由葡萄糖形成葡萄糖酸、木糖形成木糖酸、乙醇形成乙酸,并且不同底物的转化浓度、转化速度、营养要求各不相同,特别是还可以进行连续三代的直接细胞转化;①90 h最高转化山梨醇达到24 %;②118 h最高转化葡萄糖达到20 %;③140 h最高转化木糖达到10 %;④120 h最高转化乙醇的浓度达到7 %;⑤不能转化山梨糖;（3）在研究大小菌相互关系的过程中,首次发现了一种因子FA对混合菌中大菌的产孢有促进,而对大菌单独生长却没有促进现象,这也进一步表明了大小菌伴生关系的复杂性:大菌对小菌的促进产酸作用不单单是提供了营养,是一个两种菌互动的过程。（4）筛选到几种能够促进小菌单独生长和产酸的物质:①筛选到的促进因子FD、FA、DA、SA、FS都可以促进小菌单独生长;②促进因子FD、SA可以使小菌单独发酵产酸达到混合菌发酵的产酸率;③促进因子DA可以使混合菌发酵产酸提前;④促进因子SA和FD可以使混合发酵的底物浓度达到10 %;⑤促进因子FA可以促进混合菌发酵过程中大菌产孢提前;本文的创新点有以下四点:（1）所建立的快速筛选氧化底物体系具有高效、快速、简便,可以推广应用于其它氧化底物的筛选工作;（2）对混合菌之间的关系进行了进一步的研究,尤其是在营养生理上有了突出的发现,筛选到的促进因子可以使小菌单独生长、传代稳定,并且发酵产酸达到混合菌发酵产酸率,为揭开一直以来大小菌混菌培养发酵的神秘面纱指出了新的研究方向;在生产实践中,也有很大价值的指导意义;（3）首次发现了FA能够促进混合菌发酵过程中大菌产孢的提前,进一步揭示了大小菌间关系的复杂性;（4）几种促进因子可以使混合发酵的底物浓度提高到10 %,其产酸率比对照组高11.8 %,对生产实践有很大的指导作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 维生素C“二步发酵法”中转化菌的研究现状
• 1.1.1 维生素C 工业化的发展历程
• 1.1.2 “二步发酵法”中第一步发酵研究现状
• 1.1.3 “二步发酵法”中第二步发酵研究现状
• 1.1.4 对第二步混合菌中“小菌”的研究进展
• 1.1.5 “小菌”代谢的酶学研究进展
• 1.1.6 “小菌”的遗传操作研究进展
• 1.2 本课题研究的科学意义
• 第2章 仪器材料和试验方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验菌种
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 培养方法
• 2.2.1 大菌、小菌种液的配制
• 2.2.2 醋酸菌平板种子的培养
• 2.2.3 大菌种子的培养
• 2.2.4 小菌种子的培养
• 2.2.5 摇瓶发酵培养
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 PH 值测定
• 2.3.2 生长曲线的测定
• 2.3.3 还原糖的测定
• 2.3.4 测定木糖的含量
• 2.3.5 葡萄糖的测定方法
• 2.3.6 发酵液中2-KGA 含量测定
• 2.3.7 HPLC 检测2-酮基-D-葡萄糖酸
• 2.3.8.HPLC 检测木糖酸
• 第3章 两种转化菌代谢底物的研究
• 3.1 醋酸菌底物多样性筛选体系的建立
• 3.1.1 醋酸杆菌属的特征
• 3.1.2 AS 1.114 底物多样性筛选体系的建立
• 3.2 AS1.114 发酵不同底物的研究
• 3.2.1 由山梨醇转化为山梨糖的研究
• 3.2.2 由葡萄糖转化为葡萄糖酸的研究
• 3.2.3 木糖转化为木糖酸的研究
• 3.2.4 乙醇转化为醋酸的研究
• 3.2.5 转化山梨糖的研究
• 3.2.6 小结
• 3.3 普通生酮古龙酸杆菌氧化底物多样性筛选体系的建立
• 第4章 生酮古龙酸菌单独生长的研究
• 4.1 菌体的形态特征
• 4.1.1 小菌的形态特征
• 4.1.2 大菌的形态特征
• 4.1.3 混合菌发酵过程中菌体的形态特征
• 4.2 菌体量与产酸之间的关系
• 4.2.1 小菌单独生长
• 4.2.2 大菌单独生长
• 4.2.3 混菌的生长
• 4.3 筛选促进小菌单独生长的物质
• 4.3.1 几种因子FA、FD、FS、DA、SA 对小菌菌体形态的影响
• 4.3.2 促进因子对小菌单独生长的作用
• 4.3.3 促进因子对发酵产酸的作用
• 4.3.4 小结
• 4.4 促进因子对混合菌的影响
• 4.4.1 促进因子对混合菌的作用
• 4.4.2 促进因子DA 对发酵产酸的影响
• 4.4.3 促进因子对高浓度发酵的影响
• 4.4.4 大菌对小菌伴生作用的机理探索
• 结论
• 参考文献
• 致谢