磷酸甘油酸激酶1启动子核心区域的确定及转录活性的分析

论文摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是嗜肝DNA病毒的一种,常导致严重肝病,包括肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）。在HCC的形成过程中,乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染是引发肝细胞癌的主要危险因子。最近的研究发现,糖酵解与肿瘤的形成和预后关系密切。磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase PGK）是糖酵解的关键酶,在正常肝组织中,PGK1蛋白表达水平明显低于肝硬化和肝癌组织,HCC患者糖酵解作用增强,提示PGK1表达水平可作为HCC患者预后的独立指标。目的：本研究旨在应用实时荧光PCR方法证实HBx蛋白对PGK1的反式激活作用；考察HBxAg对启动子活性的影响；验证核心启动子序列中SP1结合位点具有与肝癌相关细胞系的细胞核蛋白结合的活性。方法：应用实时荧光定量PCR技术比较在HepG2.2.15细胞中与人HepG2细胞中PGK1在mRNA水平上的变化；构建PGK1-promoter荧光报告载体,通过分析其活性确定启动子的核心区域：应用凝胶迁移阻滞实验（EMSA）验证启动子核心区域的SP1位点与PGK1启动子结合活性,定点突变后检测其活性变化。结果：本研究取得以下四方面的结果。首先,HepG2.2.15细胞中PGK1 mRNA的表达量是人肝癌HepG2细胞中的3.6倍,pcDNA3.1（-）-HBx转染HepG2细胞24小时后,经过实时荧光定量PCR检测,PGK1基因mRNA水平上调2.26倍。其次,实验中成功构建PGK1-promoter1-9系列荧光素报告质粒删除体,且测序证实插入序列与理论序列一致,并在HepG2细胞中得到表达。成功定位PGK1启动子的核心区域。第三方面,PGL4.10-PGK1-promoter 1分别与pcDNA3.1（-）-HBx及pcDNA3.1（-）共转染人肝癌HepG2细胞,试验组与对照组的转录活性相比提高1.86倍。第四方面,研究发现,SP1位点具有与PGK1启动子的结合活性,定点突变后其活性丧失。结论：本研究的创新点表现在以下几个方面,HBV能够通过HBxAg上调PGK1基因表达水平；PGK1基因最小启动子活性区域位于转录起始位点上游152bp范围内（一247bp--95bp）；转录因子sp1参与PGK1转录调控过程。本研究初步揭示了HBx蛋白能够反式激活PGK1基因的表达;HBx可提高PGK1启动子的转录活性以及SP1位点可能参与PGK1的转录调控；PGK1作为糖酵解相关蛋白在HBx致病机制中的作用,为PGK1成为HBV相关HCC患者预后指标提供了有价值的线索。

论文目录

• 一、摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 二、文献综述
• 参考文献
• 三、正文
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 四、附录
• 五、致谢