论文摘要
目的:构建重组人脂联素（adiponectin）真核表达质粒,并稳定转染3T3-L1细胞,为进一步研究脂联素（ADPN）的功能提供实验基础。方法:应用限制性内切酶双酶切载有人脂联素cDNA的重组克隆质粒pMD18-T和真核表达质粒pcDNA3.1+,回收目的基因片段与线性化的真核表达质粒,经连接、转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,经酶切和核苷酸序列测定鉴定。脂质体法转染3T3-L1细胞,G418筛选4周,挑选阳性细胞克隆扩增,按Rneasy Mini Kit操作说明从细胞中提取总mRNA,凝胶电泳鉴定总RNA质量,紫外分光光度计法检测总RNA的纯度和浓度。根据报道的人脂联素基因序列,用计算机软件设计特异性引物,以总RNA为模板,通过RT-PCR的方法逆转录合成脂联素基因片段。结果:重组真核表达质粒经HindⅢ、EcoR Ⅰ酶切后获得5.4kb和800bp两个片段,大小与理论值一致。并经核苷酸序列测定证实。总RNA电泳清晰显示28S、18S、5S三条带,28/18S约2:1,A260/A280=1.9,表明提取的总RNA纯度高,其浓度为1μg/ml,RT-PCR产物经凝胶电泳后于紫外分析仪下可见在250 bp前有一清晰条带,和扩增目的基因片段长度234bp一致。结论:成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒并在3T3-L1细胞中稳定表达。
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