低分子柑橘果胶联合奥沙利铂对结肠癌细胞的协同杀伤作用及其分子机制的研究

论文摘要

背景结肠癌是消化道最常见的肿瘤之一。近些年来,随着我国人民生活水平的提高,生活习惯和饮食结构的改变,其发病率逐年上升,在所有肿瘤发病率中排名第3位。1更值得注意的是,我国结肠癌发病数已超过美国,且患者的中位发病年龄比欧美提前约十年,青年患者比欧美多见。尽管现今结肠癌的治疗方式已取得了长足的进步,但是其五年生存率并没有取得明显提高。手术与化疗结合的综合治疗是目前结肠癌治疗的标准模式。对于无法进行根治性切除或全身转移的中晚期患者,化疗不仅提高了手术治疗的效果,同时也改变了不少过去被判为不治之症而束手待毙患者的命运。然而,传统化疗药物也存在种种缺点:缺乏对正常细胞与肿瘤细胞的选择性,药物毒副反应等都限制了其治疗强度和频率;又因其存在耐药问题,使得大多数患者的治疗难以为继。目前的资料显示细胞毒化疗已经达到了治疗的平台期,现有化疗药物的重新组合难以明显提高生存。随着对肿瘤发生发展分子机制的进一步了解,发现了许多对肿瘤发生发展起关键作用的信号分子或蛋白分子。在这些理论基础上,针对这些起关键作用的信号分子或蛋白分子发展了靶向治疗。主要是通过特异性的阻断细胞的信号转导途径,控制其基因的表达及改变生物学行为;或者通过阻断肿瘤血管生成,抑制肿瘤细胞的生长和增殖,发挥抗肿瘤作用。实践已证明分子靶向治疗具有高选择性、低毒性和高治疗指数,可长期用药。在表现出更强抗肿瘤活性的同时,亦减少对正常细胞的毒副作用。这种有的放矢的治疗方法为肿瘤治疗指明了新的方向。此外,口服靶向化疗药的出现使患者可以在家接受治疗,生活质量得以显著提升。寻找新的作用靶点和针对这种靶点的高效、特异性化合物是目前抗癌工作者的迫切渴望和受到广泛重视的研究课题。低分子柑橘果胶（Low-Molecular-Weight Citrus Pectin,LCP）是一种从柑橘类水果的果皮及果浆中提取出的水溶性多糖类化合物,在经过高PH及高温处理后,能与肿瘤细胞表型的细胞亲和黏附,特异性杀伤并清除突变细胞。作为体内半乳糖凝集素-3（galectin-3）配体的竞争性抑制剂,它能够封闭肿瘤细胞表面的galectin-3位点,阻止肿瘤细胞的形成与发展。其针对的galectin-3被称为“肿瘤相关蛋白”,广泛分布于正常细胞及肿瘤细胞,参与调节细胞生长与分化,它几乎与肿瘤形成、发展与转移的全过程密切相关。奥沙利铂是结肠癌化疗的主要药物之一,属于新的铂类衍生物,是通过产生烷化结合物作用于DNA,形成链内和链间交联,从而抑制DNA的合成及复制而起到抗肿瘤作用。但在前列腺癌体外实验中,铂类药物能促使细胞核内的galectin-3磷酸化并转运至胞浆内,胞浆内磷酸化galectin-3的高表达能抑制Bad的表达并使其磷酸化,稳定线粒体膜抑制细胞色素C释放,致使细胞凋亡受阻。因此,胞浆内磷酸化的galectin-3可能是使铂类药物作用降低的原因之一。既往的研究已证实LCP可以通过作用于galectin-3对不同的细胞凋亡关键蛋白或关键途径发挥抗肿瘤效应。在与某些临床化疗药物联合应用的实验中,LCP增加化疗药物诱导凋亡反应性的同时,亦能显著逆转肿瘤细胞对化疗的耐药。截至目前为止,国内外尚无LCP与Oxaliplatin联用的文献报道。根据:包含Bcl-2家族NWGR抗死亡基序的内源性galectin-3,能抑制铂类药物诱导的细胞凋亡。诱导Bad蛋白112位上的丝氨酸磷酸化,磷酸化的Bad活性降低,从而稳定线粒体膜电位,抑制细胞色素C释放和caspase-3激活,通过内源性凋亡途径抑制凋亡作用的产生。LCP能有效对抗galectin-3引起的抗凋亡作用,从而增加铂类药物的化疗敏感性。实验目的本研究以galectin-3为靶点,通过体外实验进行以下研究:1) Oxaliplatin单药与LCP+Oxaliplatin联合用药分别对人结肠癌细胞增殖及凋亡的影响,进一步从凋亡蛋白的表达和细胞周期深入探讨其抗肿瘤的机制2)研究LCP对以铂类药物为主的结肠癌化疗效果是否具有增敏作用并探讨其机制。材料与方法1、细胞株:人结肠癌细胞株HCT116、HT-29。2、MTT比色法评价不同浓度组Oxaliplatin单药及Oxaliplatin+LCP（浓度为5mg/ml）处理上述细胞72h后对上述人结肠癌细胞的体外增殖抑制作用。3、显微镜观察不同浓度Oxaliplatin单药及联合用药处理后上述人结肠癌细胞的形态学变化。4、流式细胞仪检测IC50剂量的Oxaliplatin对上述细胞株处理不同时间后凋亡细胞比例及细胞周期的变化;IC50剂量的Oxaliplatin联合5mg/ml剂量的LCP对上述细胞株处理后凋亡细胞比例及细胞周期的变化。5、Western bloting检测IC50剂量的Oxaliplatin单用及联合5mg/ml剂量的LCP处理两种细胞株6h、24、48h后,凋亡关键蛋白procaspase-3、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表达水平的变化。6、采用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析,两组间均数比较应用两独立样本t检验方差;多组间均数比较使用单因素方差分析法,如方差齐用LDS法,方差不齐,用Dunnett-t检验方法进行两两比较。以P<0.05为差异具有显著性。所有计量资料以?χ±s表示。结果1、Oxaliplatin对2种人结肠癌细胞株在体外均有明显的增殖抑制作用,且成剂量依赖。两组细胞株对Oxaliplatin的IC50分别是:HCT116:34.00±0.59umol/L、HT-29:14.73±0.11 umol/L。LCP对上述两种人结肠癌细胞株在体外同样具有增殖抑制作用,亦且成剂量依赖。因高浓度的低分子柑橘果胶的无法溶解,故MTT实验无法顺利完成。本实验联合组LCP给予的浓度均为室温下所能溶解的最高浓度5mg/ml。2、两组结肠癌细胞, Oxaliplatin单药与Oxaliplatin+LCP联合用药各浓度组的抑制率均有差异,具有统计学意义（P<0.05）。其中以中浓度的Oxaliplatin联合低分子柑橘果胶对结肠癌细胞增殖的抑制作用最好。3、显微镜观察IC50剂量的Oxaliplatin单药及Oxaliplatin+LCP联合用药对HCT116和HT29细胞处理2h后开始出现细胞形态学改变,且随时间和浓度增加细胞出现的凋亡特征越明显,如染色质的凝聚、细胞膜起泡、细胞核断裂以及相关凋亡小体的出现。联合组较单药组凋亡表现更为明显,此结果与MTT实验结果相符。4、采用流式细胞仪检测IC50剂量的Oxaliplatin作用于HCT116和HT29细胞6、24、48h后,流式细胞仪测定凋亡细胞比例发现:与空白组相比,药物组细胞凋亡明显（P<0.05）,且呈时间依赖性。各时间组之间具有统计学意义（P<0.05）。与Oxaliplatin单药相比,相同时间联合用药能显著增加细胞凋亡比例,具有统计学意义（P<0.05）。5、Oxaliplatin单用及联合LCP可诱导G2/M期细胞增加,产生细胞周期阻滞,具有时间和浓度依赖性。联合用药组较单药组G2/M期阻滞更加明显,具有统计学意义。（P<0.05）6、应用Western blot方法检测6h、24h、48h后空白组、IC50剂量的Oxaliplatin单药组、Oxaliplatin+5mg/mlLCP联合用药组HCT116和HT29细胞凋亡关键蛋白procaspase-3、8、9、PARP、bcl-2的蛋白表达水平的情况。发现:单药组与联合用药组均出现凋亡相关蛋白procaspase-3、8、9、PARP蛋白的表达下调,联合组较单药组procaspase-3、9、PARP蛋白表达减少更加显著,两组间procaspase-8表达无明显差异。与空白组相比,Bcl-2无明显变化。结论1、Oxaliplatin+LCP联合用药较Oxaliplatin单药对结肠癌细胞的增殖抑制作用更加明显,以中浓度Oxaliplatin联合LCP的协同作用效果最佳。2、Oxaliplatin单药及联用LCP诱导的细胞凋亡随时间增加而增多,联合用药组的细胞凋亡较Oxaliplatin单药组增加更加显著。3、Oxaliplatin单用及联合LCP可对细胞周期的G2/M期进行阻滞,Oxaliplatin与LCP具有相同的周期阻滞时相,二者联用产生叠加效应,从而显著延长细胞的增殖周期。4、Oxaliplatin单用及联合LCP能显著增加procaspase-3的活化和PARP的裂解,同时活化procaspase-8、9。与单药相比,联合用药对procaspase-9的活化作用优于Oxaliplatin单用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 本研究的创新性
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 致谢