多肽Epithalon的合成及其对人胎肝细胞L-02端粒酶和端粒的作用研究

论文摘要

目的:本课题以松果体分泌物,一种名为“Epithalamin”的缩氨酸为基础,人工合成的多肽“Epithalon”其结构为:Ala-Glu-Asp-Gly。研究其作用于人肝细胞L-02后对细胞的生长情况、细胞端粒长度以及细胞端粒酶活性所产生的影响。方法:（1）采用SPPS固相多肽合成法线性合成制备Epithalon多肽,重复（缩合—洗涤—去保护—中和—洗涤）操作,达到所要合成的肽链长度;最后将肽链从树脂上裂解下来,经过高效液相法（简称HPLC纯化法）纯化处理,运用核磁技术检测H谱、C谱对其进行进一步分析鉴定。（2）通过MTT法检测Epithalon多肽对人肝细胞株L-02增殖与活力的影响;用细胞形态学观察用药后细胞的生长情况。（3）用药一段时间后,运用端粒酶重复序列扩增——焦磷酸根酶联发光技术（TRAP-ELIDA）检测人肝细胞株L-02端粒酶活性,流式荧光原位杂交法（FLOW-FISH）检测端粒长度。结果:（1）核磁与质谱结合分析鉴定的结果是合成产物正是Epithalon多肽,只是还含少许杂质。（2）MTT法检测Epithalon多肽对人肝细胞株L-02增殖与活力的影响显示:细胞在2.5umol/l至25umol/l这段随药物浓度增大而增大。对L-20细胞增殖的促进作用逐渐增加,且对浓度的限制性不大。（3）运用端粒酶重复序列扩增——焦磷酸根酶联发光技术（TRAP-ELIDA）检测人肝细胞株L-02端粒酶活性,流式荧光原位杂交法（FLOW-FISH）检测端粒长度的变化,发现Epithalon多肽能有效的激活细胞端粒酶,虽然,L-20细胞是永生细胞,但端粒酶活性表达并不强,几乎没有,但加入Epithalon多肽后却有效提高了端粒酶的活性。端粒长度的检测结果显示,加入Epithalon多肽后细胞端粒的长度得到延长。结论:研究显示Epithalon多肽具有激活端粒酶,延长端粒的作用。从目前主要的衰老理论之一的基因程控学说（端粒理论）角度来说,Epithalon多肽能以激活端粒酶活性延长端粒进而达到延长细胞寿命、生物体寿命。且由于端粒缩短的减缓,则可能更好的起到稳定染色体的作用,减少染色体因不稳定而引起的畸变等,从而减少染色体畸变导致的癌症。衰老、癌症是多因素积累的结果,但从预防角度上,Epithalon多肽也可能会是一种可行的较安全的预防治疗性药物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出及研究意义
• 1.1.1 问题的提出
• 1.1.2 研究意义
• 1.2 端粒及端粒酶的研究状况
• 1.2.1 端粒及其功能
• 1.2.2 端粒酶及其功能
• 1.2.3 端粒与细胞衰老的关系
• 1.2.4 端粒酶与细胞癌变的关系
• 1.3 EPITHALON 多肽作用现阶段的研究进展
• 1.3.1 Epithalon 多肽
• 1.3.2 国外研究现状
• 1.4 本文研究的目的和主要内容
• 1.4.1 本文研究的目的
• 1.4.2 本文研究的主要内容
• 2 EPITHALON 多肽的合成及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料及设备
• 2.3 EPITHALON 的制备
• 2.3.1 制备流程
• 2.3.2 制备的条件选择
• 2.3.3 实验操作过程
• 2.3.4 纯化和鉴定
• 2.4 合成结果分析及鉴定
• 2.4.1 多肽 Epithalon 的分子结构
• 2.4.2 质谱检测原理及结果
• 2.4.3 HPLC 纯化
• 2.4.4 核磁技术对合成物的鉴定
• 2.5 小结
• 3 EPITHALON 多肽对人肝 L-02 细胞端粒酶和端粒作用的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 细胞株
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要试剂的配制
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 培养器皿及处理
• 3.2.6 L-02 细胞的复苏、培养与传代
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 MTT 法检测Epithalon 多肽对L-02 细胞生长的影响
• 3.3.2 L-02 细胞形态学观察
• 3.3.3 流式细胞仪检测 Epithalon 多肽对 L-02 细胞周期的影响
• 3.3.4 TRAP-ELIDA 法检测端粒酶活性
• 3.3.5 FLOW-FISH 测定端粒长度
• 3.3.6 BCA 法检测蛋白质含量
• 3.3.7 统计学处理
• 3.4 结果
• 3.4.1 Epithalon 多肽对L-02 细胞生长的影响
• 3.4.2 L-02 细胞形态学观察
• 3.4.3 流式细胞仪检测 Epithalon 多肽对 L-02 细胞周期的影响
• 3.4.4 Epithalon 多肽对L-02 细胞端粒酶活性的影响
• 3.4.5 L-02 细胞端粒长度的测定
• 3.5 讨论
• 4 研究结论及后续工作建议
• 4.1 本课题研究的主要结论
• 4.2 后续工作的建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2 图片