PRGL基因的原核表达及抗体制备

论文摘要

PRGL（Proline-Rich GASA-like）是本实验室从非洲菊花瓣克隆的新基因。该基因既具有GASA的同源部分，也有与PRP基因结构相似的区域，初步认为该基因可能与GA诱导有关，并可能定位于细胞壁。为了研究PRGL的功能，本研究将编码PRGL全长的基因以及编码PRP区域的序列分别进行原核表达并制备多克隆抗体，为进一步研究奠定基础。主要研究结果如下：本实验用pET32a构建pET32a-PRGL原核表达载体，经DNA测序正确后，在菌液起始浓度OD600为0.6，IPTG浓度为0.6mM，28℃诱导时间为6h条件下，诱导表达出34.76kD的PRGL目的蛋白。用pET30c构建pET30c-PRP原核表达载体，经DNA测序正确后，在菌液起始浓度OD600为0.6，IPTG浓度为1.0mM，28℃诱导时间为6h条件下，获得13.64kD的含有PRP区域的目的蛋白。随后利用融合蛋白中自带的His标签，证明了融合蛋白表达的正确性。通过对诱导表达后的蛋白进行定量，注射新西兰兔进行免疫。在对家兔进行免疫之前，先耳缘静脉取血，获得血清，-80℃冻存以作空白对照。经三次加强免疫后，用Elisa检测免疫后抗体的产生，发现以上两种抗体在稀释600倍时仍然具有免疫活性。用诱导表达后的大肠杆菌总蛋白为抗原，免疫前及免疫后的血清为一抗，HRP为二抗，进行Western Blot检测免疫后抗体的有效性，证实PRGL蛋白以及PRP蛋白的多克隆抗体已制备成功。采用PRGL蛋白抗体，以Western Blot初步检测了非洲菊P2和P6花瓣的蛋白表达，发现P2花瓣有一特异条带，对此条带的出现进行了讨论。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 非洲菊
• 1.2 赤霉素
• 1.3 GASA
• 1.3.1 GASA产物的定位
• 1.3.2 GASA家族基因蛋白间氨基酸序列比较
• 1.3.3 GASA基因的表达模式
• 1.4 富含脯氨酸蛋白（PRPs）
• 1.4.1 PRPs的结构
• 1.4.2 PRPs蛋白的功能—分子间的相互作用及其功能
• 1.5 PRGL
• 1.6 多克隆抗体
• 1.6.1 多克隆抗体的概念
• 1.6.2 多克隆抗体的制备方法
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 药品与仪器
• 2.1.2 PCR引物
• 2.1.3 载体以及原核表达的试剂及其配制
• 2.1.4 Western Blot检测的试剂配制
• 2.1.5 用于制备抗体以及抗体检测的材料
• 2.1.6 植物总蛋白提取液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 PRGL基因及PRP片段原核表达的载体构建
• 2.2.2 PRGL基因及PRP片段的原核表达
• 2.2.3 PRGL基因及PRP片段原核表达正确性的Western Blot检测
• 2.2.4 融合蛋白表达量的确定
• 2.2.5 PRGL和PRP抗体的制备
• 2.2.6 抗体效价的Elisa检测
• 2.2.7 抗体有效性的Western Blot检测
• 2.2.8 植物总蛋白的提取
• 3 结果与分析
• 3.1 非洲菊花瓣总RNA的提取
• 3.2 pET32a-PRGL原核表达载体的构建
• 3.2.1 pET32a原核表达载体的检测
• 3.2.2 PRGL基因的获得
• 3.2.3 pET32a-PRGL重组载体的构建
• 3.2.3.1 pET32a-PRGL重组载体的PCR检测
• 3.2.3.2 pET32a-PRGL重组载体的双酶切检测
• 3.2.3.3 pET32a-PRGL重组载体的单酶切检测
• 3.2.3.4 pET32a-PRGL重组载体的测序检测
• 3.3 pET30c-PRP原核表达载体的构建
• 3.3.1 pET30c原核表达载体的检测
• 3.3.2 PRP基因片段的获得
• 3.3.3 pET30c-PRP重组载体的构建
• 3.3.3.1 pET30c-PRP重组载体的PCR检测
• 3.3.3.2 pET30c-PRP重组载体的双酶切检测
• 3.3.3.3 pET30c-PRP重组载体的单酶切检测
• 3.3.3.4 pET30c-PRP重组载体的测序检测
• 3.4 PRGL基因及PRP片段的原核表达
• 3.4.1 pET32a-PRGL重组载体的诱导表达
• 3.4.1.1 不同诱导时间对pET32a-PRGL载体表达的影响
• 3.4.1.2 不同IPTG浓度对pET32a-PRGL重组载体诱导表达的影响
• 3.4.2 pET30c-PRP重组载体的诱导表达
• 3.4.2.1 不同诱导时间对pET30c-PRP载体表达的影响
• 3.4.2.2 不同IPTG浓度对于pET30c-PRP重组载体诱导表达的影响
• 3.5 PRGL及PRP片段原核表达的Western Blot检测
• 3.5.1 Western Blot检测pET32a-PRGL诱导表达后的目的蛋白
• 3.5.2 Western Blot检测pET30c-PRP诱导表达后的目的蛋白
• 3.6 原核表达的融合蛋白量的确定
• 3.6.1 pET32a-PRGL原核表达目的蛋白含量的确定
• 3.6.2 pET30c-PRP原核表达目的蛋白含量的确定
• 3.7 Elisa检测多克隆抗体效价
• 3.7.1 PRGL抗体的Elisa效价测定
• 3.7.2 PRP抗体的Elisa效价测定
• 3.8 多克隆抗体有效性的Western Blot检测
• 3.8.1 PRGL抗体的有效性测定
• 3.8.2 PRP抗体的有效性测定
• 3.9 PRGL蛋白的初步研究
• 4 讨论
• 4.1 载体构建与原核表达
• 4.2 抗体制备
• 4.3 蛋白的初步研究
• 5 结论
• 6 今后工作的设想
• 7 参考文献
• 致谢