癌胚抗原mRNA及SW480细胞总RNA负载成熟树突状细胞体外诱导的特异性抗肿瘤作用

论文摘要

树突状细胞（dendritic cell ,DC）作为体内功能最强大的专职抗原提呈细胞,具有强大的抗原提呈及T细胞激活功能。近年来,体外通过各种方式将肿瘤信息负载于DC后传递给免疫系统,激发特异性的抗肿瘤反应来制备DC肿瘤疫苗成为肿瘤治疗的研究热点。本研究用电穿孔方法转染癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）mRNA和结肠癌细胞株SW480总RNA至成熟树突状细胞（mature dendritic cell, mDC）内制备RNA-DC疫苗,观察体外诱导的特异性抗肿瘤效应。共分4部分:1体外制备形态、功能正常的DC。2采用基因工程技术构建pcDNA3.1（+）- CEA体外转录载体,并转录为CEAmRNA。3电穿孔方法将体外转录的CEAmRNA转染入mDC,并检测体外诱导的抗肿瘤效应。4电穿孔法将SW480细胞株总RNA转染入mDC,检测体外诱导的抗肿瘤效应,并与转染CEAmRNA的DC体外诱导的抗肿瘤效应进行比较。研究结果表明电穿孔法能将编码肿瘤相关性抗原（CEA）的mRNA和肿瘤细胞（SW480）总RNA转染入mDC内,且未改变DC的基本特征。负载肿瘤RNA的mDC能在体外诱导抗原特异性和肿瘤特异性的抗肿瘤效应,且转染SW480总RNA的mDC能诱导更全面的抗肿瘤效应。本研究创新性的应用了体外转录的CEAmRNA和SW480总RNA转染入mDC内,并在体外诱导了特异性抗肿瘤效应。目前,尚未见有关于此的报道。

论文目录

• 提要
• 中英文缩写
• 文献综述
• 综述1 树突状细胞的研究进展
• 1.1 DC 的分类及分化发育成熟
• 1.2 DC 的迁移机制
• 1.3 DC 的抗原处理与提呈功能
• 1.4 DC 在机体免疫系统中的作用
• 1.5 DC 的体外制备
• 1.6 DC 肿瘤疫苗
• 1.7 展望
• 综述2 RNA 转染树突状细胞制备肿瘤疫苗的研究进展
• 2.1 DC 肿瘤疫苗与RNA-DC 肿瘤疫苗
• 2.2 RNA-DC 疫苗诱导人抗原特异性CTL 的体外研究
• 2.3 RNA-DC 疫苗的临床研究
• 2.4 结语
• 前言
• 第1章 人外周血单个核细胞来源的树突状细胞体外培养及鉴定
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器和耗材
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 DC 的体外诱导
• 1.2.2 DC 形态学观察
• 1.2.3 流式细胞术检测细胞表型
• 1.2.4 MTT 法检测DC 刺激T 细胞增殖能力
• 1.2.5 统计学方法
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 DC 形态学观察
• 1.3.2 DC 表型检测
• 1.3.3 DC 刺激T 细胞增殖能力
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 人癌胚抗原基因的克隆及体外转录
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 主要材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SW480 细胞培养
• 2.2.2 SW480 细胞总RNA 提取
• 2.2.3 RT- PCR 方法扩增CEA cDNA
• 2.2.4 CEA 克隆载体pMD18-T-CEA 的构建与鉴定
• 2.2.5 CEA 基因mRNA 体外转录载体pcDNA3.1-CEA 的构建
• 2.2.6 CEA 基因的体外转录
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 SW480 细胞总RNA 提取
• 2.3.2 CEAcDNA（两端带有XbaI 和EcoR I 酶切位点）的获得
• 2.3.3 重组克隆质粒pMD18-T-CEA 的双酶切鉴定
• 2.3.4 重组克隆质粒pMD18-T-CEA 测序鉴定
• 2.3.5 重组体外转录质粒pcDNA3.1-CEA 双酶切鉴定
• 2.3.6 pcDNA3.1-CEA 体外转录为CEAmRNA
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 癌胚抗原mRNA 负载成熟树突状细胞体外诱导的特异性抗肿瘤作用
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 主要材料
• 3.1.2 主要仪器和耗材
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 外周血DC 的体外诱导与培养
• 3.2.2 复苏同种异体T 淋巴细胞
• 3.2.3 CEAmRNA 体外负载DC
• 3.2.4 转染后mDC 内CEA 蛋白表达
• 3.2.5 电穿孔对DC 的影响检测
• 3.2.6 MTT 法检测DC 刺激T 细胞增殖能力
• 3.2.7 ELISA 法检测负载CEAmRNA 后的DC IL-12 分泌水平
• 3.2.8 CEAmRNA 负载DC 后体外诱导CTL 及特异性细胞毒实验
• 3.2.9 ELISA 法检测诱导的CTL IFN-γ分泌
• 3.2.10 统计学方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 转染后DC 内CEA 表达
• 3.3.2 电穿孔对DC 的影响
• 3.3.3 各组DC 刺激T 细胞增殖能力
• 3.3.4 各组DC IL-12 分泌水平
• 3.3.5 转染CEA 的DC 诱导的特异性细胞毒效应
• 3.3.6 转染CEAmRNA 的DC 诱导CTL 的IFN-γ分泌
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 SW480 总RNA 负载成熟树突状细胞体外诱导的特异性抗肿瘤作用
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 主要材料
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 肿瘤细胞总RNA 提取及定量
• 4.2.3 肿瘤细胞总RNA 体外负载DC
• 4.2.4 转染后mDC 内CEA 蛋白表达
• 4.2.5 SW480 总RNA 负载DC 后体外诱导CTL 及特异性细胞毒实验
• 4.2.6 ELISA 法检测诱导的CTL IFN-γ分泌
• 4.2.7 统计学方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 转染SW480 总RNA 的DC 内CEA 蛋白表达
• 4.3.2 转染肿瘤总RNA 的DC 诱导的肿瘤特异性细胞毒效应
• 4.3.3 转染SW480 总RNA 的DC 诱导CTL 的IFN-γ分泌
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract