江苏部分地区猪圆环病毒2型的检测及其免疫接种试验

论文摘要

PCV为圆环病毒科（circoviridae）圆环病毒属（circovirus）成员,主要包括PCV1和PCV2。其中,PCV1仍没有明确其对猪的致病性,但已发现PCV2对猪具有广泛的高度易感性,且主要攻击免疫器官,导致严重的免疫抑制；并与其他病原体混合感染,使养猪业蒙受很大的经济损失。研究该病原的检测方法、调查该病的流行病学以及探讨防制该病的预防措施,是当前国内外养猪业密切注视的热点。为调查江苏地区PCV2（porcine circovirus type2）（?）勺感染状况,本研究根据GenBank中发表的PCV2基因组序列,设计一对特异性核苷酸引物。通过对已知PCV2和对照病毒的PCR扩增,证明了所设计的引物可用于PCV2的特异性PCR检测。采集来自江苏扬州和泰州地区157个发病猪群的病料（脾脏、腹股沟淋巴结）并进行PCV2的检测,结果发现其中70.70%的猪群存在PCV2感染。采集扬州某屠宰场的32份临床健康猪的病料,结果表明其中71.88%存在PCV2感染。通过对临床发病猪与健康猪的检测结果的比较,可以看出扬州地区发病猪群和临床健康猪群的PCV2感染率无显著性差异,这提示PCV2在猪群中已经广泛感染,并可能是当前猪病的辅助致病因子。为确定PCV2江苏分离株可能存在的基因多样性,用PCR方法从分离的6株PCV2江苏分离株（TZ60607、TZ60804、YC60711、YZ60615、YZ60721、YZ70717）扩增出全基因组DNA序列,并克隆入质粒载体pGEM-T easy。通过氨苄青霉素抗性、蓝白斑特性以及酶切分析,获得6个含有相应片段的重组质粒。序列测定结果表明,6株病毒的基因组大小均为1767bp。分析表明所检测的6株PCV2与GenBank中发表的毒株之间核苷酸序列同源性均很高,介于94.6%-100%之间；且与浙江分离株、福建分离株、江苏分离株亲缘关系较近,与多数中国分离株亲缘关系较近并形成较大的一簇,而与美国分离株、加拿大分离株遗传关系相对较远。为制备检测临床PCV抗体的诊断抗原以及研制PCV单克隆抗体的免疫抗原,根据已经发表的PCV1和PCV2的衣壳蛋白基因（cap）分别设计一对引物,利用PCR法从已知的PCV1和PCV2中各扩增到一DNA片断。将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶（GST）基因的下游,获得重组质粒pCAP-PCV1和pCAP-PCV2,并分别转化大肠杆菌BL21。序列测定表明,所克隆的序列大小均为579bp,其中PCV1的cap与GenBank中的U49186序列一致,PCV2的cap与DQ104422序列一致。通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析和Western-blotting鉴定,证明携带重组质粒pCAP-PCV1或pCAP-PCV26勺大肠杆菌均可以表达融合蛋白形式的衣壳蛋白（分别命名为GST-CAP1和GST-CAP2,分子量约为49ku）。以大肠杆菌表达的PCV2（porcine circovirus type2）重组衣壳蛋白（GST-CAP2）为抗原,按照一定的免疫程序接种BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0按照常规杂交瘤技术进行融合。以GST-CAP2以及PCV1（porcine circovirus type1）重组衣壳蛋白（GST-CAP1）为包被抗原,经间接ELISA筛选获得2株能稳定分泌针对PCV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株（M1和G1）。通过dot-ELISA、Western-blot以及间接免疫荧光（IFA）技术证明了G1株分泌的单抗同时识别PCV1和PCV2,而Ml株分泌的单抗则特异性针对PCV2。该单抗的制备将为进一步建立快速检测PCV的方法打下了基础。为建立猪群PCV2的血清流行病学监测技术,以大肠杆菌表达的PCV2重组衣壳蛋白（His-CAP2）为抗原,建立了用于检测PCV2抗体的间接ELISA法。通过对ELISA的反应条件比较,确定了His-CAP2的最适包被浓度为6.4μg/mL,待检血清稀释度为1：40,羊抗猪IgG-HRP的工作浓度为1：5000。且该ELISA方法具有良好的特异性,与猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清没有交叉反应,可以用于PCV2抗体的检测。利用建立的间接ELISA方法对来自苏中地区不同猪场的175份血清样本进行了检测,结果发现70.29%为PCV2抗体阳性,这与临床上PCV2感染导致猪群发病的实际情况是相符合的。通过PK15细胞感染、甲醛灭活,制备了PCV2全病毒灭活抗原；通过对含有PCV2衣壳蛋白的重组表达质粒pCAP-PCV2的大肠杆菌的培养、诱导,获得了PCV2重组衣壳蛋白（GST-CAP2）抗原。于江苏畜牧兽医职业技术学院姜曲海种猪场,选取同群的18头60日龄的健康仔猪,随机分为3组,第一组以PCV2全病毒灭活抗原免疫组,第二组以GST-CAP2抗原免疫组,第三组以生理盐水作为对照组,剂量1mL/头。通过对猪群的免疫前后的血清进行ELISA检测,结果表明,PCV2全病毒抗原和GST-CAP2均能够刺激机体产生抗PCV2衣壳蛋白抗体,且在抗原免疫后的第20天抗体水平均达到高峰,并显著高于生理盐水对照；抗体维持期至少25天。进一步比较发现GST-CAP2刺激机体产生的抗体水平低于PCV2全病毒抗原免疫组。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一部分 文献综述
• 1 分类地位
• 2 病原学
• 3 致病性
• 4 病毒基因组及主要结构和功能蛋白的特性
• 5 猪圆环病毒2型的诊断
• 6 猪圆环病毒2型的相关疾病
• 7 防制措施
• 第二部分 实验部分
• 第一章 猪圆环病毒2型PCR检测及其分子流行病学
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二章 江苏地区6株PCV2分离株全基因的克隆与分析
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 猪圆环病毒衣壳蛋白基因的克隆及原核表达
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 猪圆环病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第五章 猪圆环病毒2型感染的血清学检测
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第六章 猪圆环病毒2型免疫接种的探索
• 摘要
• Abstract
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表论文
• 致谢