论文摘要
本实验室于2000年报道克隆到了1个编码新的人α-甘露糖苷酶的cDNA（6A8）,国际上统一命名此α-甘露糖苷酶为MAN2C1。本实验室以往研究观察到,人鼻咽癌细胞CNE-2L2的Man2c1基因表达在用反义技术抑制后,细胞在体外培养中的生长、细胞接种裸鼠后的肿瘤性生长及所长肿瘤的肺转移明显受抑。鉴于肿瘤的恶性生物学行为受众多因素影响,本论文首先用点有已知癌基因、肿瘤抑制基因、凋亡相关基因、免疫相关基因和其他基因等共1069个基因的DNA芯片,藉mRNA微列阵差异分析,比较了Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞与Man2c1基因表达正常的CNE-2L2细胞基因表达的差异。在SAM分析中,阈值若为0.416,Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞与Man2c1基因表达正常的CNE-2L2细胞间有182条基因表达有差异。若将阈值提高到0.548,则差异表达的基因数为70条。其中26条基因在Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞表达上调,44条基因在Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞表达下调。表达上调可能对肿瘤的恶性行为有抑制作用的基因有P130 mRNA for130K protein,TGF-betaIIR alpha,GABBR1,TGFBR1,TNFAIP1,STANIN,E-CADHERIN,CTNNA1,CTNNA 2,RFX2及TMPO等,表达下调可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有CD44,NDRG1,TGFB1,RPS5,LEGUMAIIN CBS,CD59及SNRPA1等。CD44分子是介导细胞-细胞外基质相互作用的典型粘附分子。它在肿瘤生长转移中发挥重要作用,与肿瘤恶性生物学行为密切相关。因此,本论文深入探讨了CD44表达与CNE-2L2细胞恶性生物学行为的关系。RT-PCR、Western印迹和免疫荧光染色流式细胞仪分析从mRNA和蛋白质水平确认了Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞中CD44表达的抑制。但Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞中CD44异构体的表达和CD44分子的N-糖基化与Man2c1基因表达正常的CNE-2L2细胞无差别。随后,我用RNAi技术抑制野生型CNE-2L2细胞（本论文中称为W细胞）中CD44mRNA的表达,制备了CD44 mRNA表达抑制的CNE-2L2细胞（本论文中称为AS细胞）。我对此细胞作了克隆,藉Western印迹挑选了4个CD44表达明显抑制的克隆（简称ASC1,ASC2,ASC3和ASC4）。我以W细胞和感染含空载体的病毒的细胞（本论文中称为M细胞）作对照,分析了ASC1和ASC2细胞的生物学行为。以相同细胞密度接种于培养瓶中,W细胞和M细胞在开始数天呈分敞生长,而ASC1和ASC2细胞则很快聚集成团。在生长曲线实验中,M细胞的生长曲线与W细胞相比无明显差异,但ASC1和ASC2细胞的生长明显减慢（P＜0.01）。ASC1、ASC2、W和M细胞在软琼脂中的集落形成率分别为7.3±0.5%、8.5±0.5%、21.3%±0.7和22.1%±0.4。ASC1和ASC2细胞与W和M细胞相比,集落形成率有显著差异（P＜0.01）。ASC1和ASC2细胞形成的集落也明显小于W和M细胞,且集落发暗,W和M细胞形成的集落则发亮,有折光性。细胞接种于裸鼠,接种W细胞的8只小鼠中有8只有肿瘤性生长,实验8周末时的平均瘤重达1.56±0.65g。接种M细胞的8只小鼠中也有8只有肿瘤性生长,实验8周末时的平均瘤重达1.24+0.86g。但接种ASC1细胞的8只小鼠中只有3只有肿瘤性生长,实验8周末时的平均瘤重只有0.22±0.09g。接种ASC2细胞的8只小鼠中只有4只有肿瘤性生长,实验8周末时的平均瘤重只有0.28±0.13g。ASC1和ASC2细胞与W和M细胞相比,平均瘤重有显著差异（P＜0.01）。CNE-2L2细胞所长的肿瘤有高肺转移的特点。4组小鼠的肺脏正在做组织切片,以分析比较肿瘤肺转移的情况。细胞周期流式细胞仪分析显示,W和M细胞在G0/G1期者分别为44.4%和44.9%,在S期者分别为39.3%和39.3%,而ASC1和ASC2细胞在G0/G1期者分别为53.9%和53.3%,在S期者分别为27.1%和28.2%。这表明RNA干扰抑制CD44表达的细胞生长缓慢在一定程度上与进入S期的细胞减少相关。CD44分子的体内天然配体是广泛表达于基质中的透明质酸,肿瘤细胞表面的CD44分子与基质中的透明质酸间的粘附作用在肿瘤细胞的浸润转移中起重要作用。本论文工作显示,与W和M细胞相比,ASC1和ASC2细胞与包被有透明质酸的培养板孔底的粘附明显下降。本论文工作还观察到,W和M细胞的E-Cadherin表达极弱,但ASC1和ASC2细胞的E-Cadherin表达明显增强。有文献报道,E-cadherin能负向调节CD44的表达。本研究观察到CD44表达也能负向调节E-cadherin的表达。鉴于E-cadherin与肿瘤,特别是上皮性肿瘤的恶性生物学行为密切相关,其表达增强在CD44表达抑制的细胞的恶性生物学行为减弱中一定起着作用。本论文工作表明,CD44表达的抑制能使人鼻咽癌细胞CNE-2L2的恶性生物学行为减弱,其表达抑制是用反义技术抑制Man2c1基因表达致CNE-2L2细胞恶性生物学行为减弱的机制之一。Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞与Man2c1基因表达正常的CNE-2L2细胞也提供了寻找新的肿瘤细胞恶性生物学行为相关基因的机会。我为此分别构建了Man2c1基因表达抑制的CNE-2L2细胞与Man2c1基因表达正常的CNE-2L2细胞的cDNA文库。但由于时间所限,未能做深入的新基因克隆研究。