炭疽芽孢杆菌MLVA分子分型研究

论文摘要

炭疽病是由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的人兽共患传染病,曾多次被恐怖分子用来发动生物恐怖袭击。随着国际上生物战剂的研究发展和恐怖组织的活动频繁,炭疽越来越对人畜构成了威胁,因此建立快速、经济的分子分型方法,对预防和控制炭疽芽孢杆菌的大面积爆发和流行来说显得非常必要。本研究对我国的炭疽芽孢杆菌进行了可变数目串联重复序列分析（Multiple Locus Variable- Number Tandem Repeats Analysis, MLVA）分析,初步探讨了可变数目串联重复（Variable Number Tandem Repeat, VNTR）位点在炭疽芽孢杆菌中的多态性,以及中国地区的主要流行菌株之间的遗传关系。本文使用经典的苯酚氯仿方法,对全国各炭疽自然疫源地分离到的198株炭疽芽孢杆菌的基因组DNA进行了提取。利用Tandem Repeats Finder软件进行生物信息学分析后,最终选取了18个VNTR多态性位点。针对不同的VNTR多态性位点两端的基因组序列,设计了特异性荧光标记引物,PCR扩增后通过毛细管电泳检测。通过Genemarker软件确定PCR扩增片段长度,计算每个菌株不同串联重复位点拷贝数。采用Bionumerics软件分析,选用非加权组平均法（UPGMA）对炭疽芽孢杆菌进行聚类分析,研究炭疽芽孢杆菌菌株之间的遗传差异。结果表明：使用18个串联重复位点进行UPGMA聚类分型,可鉴定出96个基因型。按遗传学距离归纳为2个集群A和B,共分为4个组Al,A2,B 1,B2。A1组可划分为两个亚组A1.a,Ai.b,B1组可划分为两个亚组B1.a，B1.b。B2组也可划分为两个亚组B2.a,B2.b。炭疽芽孢杆菌分布主要集中在A1.b亚群以及B1组和B2组中。A1.b亚群主要分布的基因型为4、18和31,Bl组主要分布的基因型为57、59、68、77和78,B2组主要分布的基因型为84和92。VNTR多态性位点多态性信息含量分析结果显示,Bams1、Bams34、A031、Bams3、VrrC1、Bams30、VrrC2、Bams31八个VNTR多态性位点具有较高的多态性,确定了一个新的VNTR多态性位点A031。选用这八个多态信息含量最高位点进行组合后对炭疽芽孢杆菌进行UPGMA聚类分析,可鉴定出66个基因型。本论文的初步研究结果将对推动我国炭疽芽孢杆菌的分子分型,保障我国在生物防控领域的监控水平,起到积极的推动作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 绪论
• 1.1 炭疽芽孢杆菌的概述
• 1.1.1 炭疽芽孢杆菌的生理生化特征
• 1.1.2 炭疽芽孢杆菌的毒力因子
• 1.1.3 炭疽芽孢杆菌分布特性
• 1.1.4 炭疽芽孢杆菌传播类型及临床表现
• 1.1.5 炭疽芽孢杆菌预防和监测
• 1.2 炭疽芽孢杆菌分子分型研究现状
• 1.2.1 脉冲场凝胶电泳
• 1.2.2 限制性片段长度多态性
• 1.2.3 随机扩增多态性DNA标记
• 1.2.4 多位点序列分型技术
• 1.2.5 扩增片段长度多态性
• 1.2.6 多位点可变数量串联重复序列分析
• 1.2.7 单核苷酸多态性
• 1.3 本研究目的和意义
• 第二章 炭疽芽孢杆菌MLVA分子分型研究
• 2.1 炭疽芽孢杆菌MLVA分型技术方案
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验菌株
• 2.2.2 主要试剂和仪器设备
• 2.2.3 炭疽芽孢杆菌基因组DNA的提取
• 2.2.4 VNTR多态性位点引物设计
• 2.2.5 PCR扩增条件
• 2.2.7 PCR产物上样及检测
• 2.2.8 PCR产物纯化
• 2.2.9 PCR产物毛细管电泳前处理
• 2.2.10 测序仪对样品进行GeneScan分析
• 2.2.11 VNTR重复序列的拷贝数计算
• 2.2.12 VNTR多态性位点的多态性信息含量分析
• 2.2.13 菌株间亲缘关系分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 VNTR多态性位点选择以及设计
• 2.3.2 读取VNTR多态性位点PCR扩增片段长度信息
• 2.3.3 VNTR多态性位点串联重复数统计
• 2.3.4 MLVA位点多态性信息含量分析
• 2.3.5 菌株间亲缘关系分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 多态性串联重复序列位点选择
• 2.4.2 MLVA多态性位点筛选策略
• 2.4.3 MLVA分型重复单元拷贝数的确定
• 2.4.4 多态性检测的条件的确定
• 2.4.5 炭疽芽孢杆菌MLVA分型国内外研究比较
• 第三章 结论与展望
• 3.1 结论
• 3.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果