橡胶树胶乳再生相关基因的cDNA-AFLP筛选与分析

论文摘要

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）产生的天然橡胶是关系国计民生的重要工业原料和战略物资,我国自给率严重不足,但因实际植胶面积己达极限,大幅提高橡胶单产成为发展我国天然橡胶产业的唯一可靠出路。在正常割胶的橡胶树中,乳管细胞的主要代谢活动是进行胶乳的再生,而胶乳再生能力的强弱是决定橡胶树产量的主要因素之一。胶乳再生涉及到一个复杂的生理生化过程,但是生物体的一切外在表现都离不开内在相关基因的表达调控。因此,高通量研究胶乳再生过程中转录组水平的基因表达情况,将为筛选鉴定胶乳再生关键调控基因和阐明胶乳再生的分子机理奠定良好基础,也为橡胶树定向分子育种提供重要的靶标基因和理论指导。在未开割橡胶树中,割胶对胶乳再生的促进作用表现得尤为突出,这一特性使其成为研究胶乳再生分子调控机制的理想材料。本研究使用高通量手段比较分析了未开割橡胶树开割后前几个刀次胶乳转录组的表达谱,主要研究结果如下：1.首次系统分析了未开割橡胶树割胶后胶乳转录组的动态变化采用本实验室改进的银染cDNA-AFLP技术,使用Apo I IMse I酶切体系全部128对选择性引物组合,分析了割胶后前5个刀次胶乳mRNA的表达情况,每个样本共分离到约9000条转录衍生片段（TDFs）。以第1刀胶乳TDF表达量为参照,选取651个差异表达的TDFs （DE-TDFs）进行了克隆、测序和同源注释；并结合本实验室胶乳EST数据库和注释结果,整合表达模式和注释均一致的差异片段,最终获得505个非冗余的DE-TDFs,其中有217个呈上调表达,180个下调表达和108个钟型表达（先上调后下调或先下调后上调）。功能分类结果显示,其中的366个（72.5%）DE-TDFs与功能分类明确蛋白同源,17.6%（89）属于功能分类不明确或推测蛋白,仅50个（9.9%）未在数据库中找到同源匹配序列。依据这366个功能分类明确的DE-TDFs在细胞内行使的功能,将其分为11个类别,按所占比例由高到低依次为：转录和蛋白质合成、肋胁迫和防御、转运蛋白和胞内运输、信号转导、蛋白质降解和贮存、初级代谢、能量、细胞生长和分裂、细胞结构、次级代谢和橡胶烃生物合成。2.筛选到多个胶乳再生相关基因,初步阐释了胶乳再生的几个关键代谢途径在未开割橡胶树割胶后的前5个刀次,随着割胶活动的进行,乳管细胞内出现mRNA和蛋白质合成能力增强、物质运输能力加大、蛋白质降解和更新速率加快、胁迫防御机制被启动以及各种信号通路被激活等现象,表明割胶产生明显的库效应和伤效应,割胶应答涉及多个不同功能类别基因的参与。分离到多个参与蔗糖转运、蔗糖分解代谢、糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径的基因片段,它们多数受割胶调控呈上调表达；值得注意的是,筛选到的9个橡胶烃生物合成基因全部随割胶上调表达,由此推测蔗糖的供给与糖代谢调控、橡胶烃生物合成是未开割橡胶树割胶后乳管细胞代谢活动的主要内容,同时也是胶乳再生能力增强的主要原因。3. cDNA-AFLP技术是筛选橡胶树差异表达基因的有效且可靠手段随机选取约1/10的DE-TDFs设计特异引物,使用半定量RT-PCR分析其表达情况,发现有81.25%的DE-TDFs与原cDNA-AFLP分析的表达模式一致,表明本次筛选工作的可靠性高。同时,使用qRT-PCR分析了37个与胶乳再生调控相关的DE-TDFs,结果显示多数基因的表达模式与相应DE-TDFs最初表达模式一致。本文研究结果不仅有助于进一步筛选与鉴定覆盖整个胶乳再生调控网络的关键基因,而且初步阐述了决定胶乳再生调控的几个关键代谢途径,为深入揭示胶乳再生的分子机制提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 我国天然橡胶事业的发展现状
• 1.1.1 橡胶树概述和分类
• 1.1.2 天然橡胶是关系国计民生的工业原料
• 1.1.3 我国迫切需要大幅度提高橡胶单产
• 1.1.4 大幅提高橡胶单产在客观上是可行的
• 1.2 橡胶树产胶的生理基础
• 1.2.1 胶乳的基本属性
• 1.2.2 胶乳的主要成分
• 1.2.3 橡胶树的产胶细胞——乳管
• 1.2.4 橡胶烃生物合成途径
• 1.2.5 影响橡胶树胶乳产量的主要因子
• 1.3 橡胶树已克隆基因的研究进展
• 1.3.1 橡胶烃生物合成关键基因的克隆
• 1.3.2 其它相关基因的克隆
• 1.4 胶乳再生调控机制的分子生物学研究进展
• 1.4.1 碳水化合物供给与分解代谢调控
• 1.4.2 橡胶烃生物合成的调控
• 1.4.3 能量供给和腺苷合成的调控
• 1.4.4 黄色体在胞质pH值稳态中的调控作用
• 1.5 未开割橡胶树是研究胶乳再生机制的理想材料
• 1.6 cDNA-AFLP技术是高通量筛选差异表达基因的有效途径
• 1.7 本研究的目的和意义
• 1.8 技术路线图
• 2 实验材料与试剂
• 2.1 植物材料
• 2.2 质粒与菌株
• 2.3 分子生物学试剂盒
• 2.4 生化试剂
• 3 实验方法与步骤
• 3.1 胶乳总RNA的提取和检测
• 3.1.1 胶乳的采集
• 3.1.2 胶乳总RNA的提取
• 3.1.3 胶乳总RNA的质量检测
• 3.1.3.1 胶乳总RNA浓度和纯度测定
• 3.1.3.2 胶乳总RNA完整性检测
• 3.2 半定量RT-PCR调整胶乳总RNA用量
• 3.2.1 逆转录合成cDNA第一链
• 3.2.2 半定量RT-PCR调整模板
• 3.3 mRNA的纯化
• 3.4 双链cDNA的合成
• 3.4.1 cDNA第一链的合成
• 3.4.2 cDNA第二链的合成和质量检测
• 3.4.3 cDNA双链的纯化
• 3.5 cDNA样品的酶切和接头的连接
• 3.5.1 cDNA样品的双酶切
• 3.5.2 酶切片段的加接头反应
• 3.6 cDNA片段的预扩增
• 3.7 选择性PCR扩增
• 3.8 转录本衍生片段（Transcript-derived fragments,TDFs）的分离
• 3.8.1 胶板的制备
• 3.8.2 电泳
• 3.8.3 银染程序
• 3.9 差异表达的TDF片段（Differentially expressed TDFs,DE-TDFs）的获取、纯化、克隆和测序
• 3.9.1 DE-TDFs的获取
• 3.9.2 DE-TDFs的纯化
• 3.9.2.1 DE-TDFs的再扩增
• 3.9.2.2 目的条带的回收
• 3.9.3 DE-TDFs的克隆
• 3.9.4 菌落PCR鉴定阳性克隆和测序
• 3.10 银染cDNA-AFLP技术的有效性检测
• 3.10.1 逆转录合成cDNA第一链
• 3.10.2 调整模板量
• 3.10.3 表达模式分析
• 3.11 荧光实时定量PCR（qRT-PCR）分析候选DE-TDFs的表达模式
• 3.11.1 逆转录合成cDNA第一链
• 3.11.2 检测qRT-PCR引物特异性
• 3.11.3 制作qRT-PCR引物标准曲线
• 3.11.4 候选基因表达模式分析
• 4 结果与分析
• 4.1 未开割橡胶树胶乳总RNA样品的纯度和完整性检测
• 4.1.1 胶乳总RNA的OD值测定
• 4.1.2 胶乳总RNA的甲醛变性凝胶电泳检测
• 4.2 cDNA-AFLP银染分析
• 4.2.1 模板的制备
• 4.2.1.1 双链cDNA合成的质量检测
• 4.2.1.2 预扩增PCR质量检测
• 4.2.2 转录衍生片段（Transcript Derived Fragments,TDFs）的分离
• 4.3 差异表达TDFs（Different Expressed of Transcript Derived Fragments,DE-TDFs）的筛选
• 4.4 DE-TDFs的同源注释和聚类整理
• 4.4.1 序列预处理与同源注释
• 4.4.2 冗余DE-TDFs的聚类整理
• 4.5 非冗余DE-TDFs的功能分类统计分析
• 4.5.1 DE-TDFs功能分类初步统计
• 4.5.2 功能分类明确DE-TDFs的统计
• 4.5.3 DE-TDF主要功能类别分析
• 4.6 非冗余DE-TDF同源注释和分类汇总表
• 4.7 银染cDNA-AFLP技术的有效性分析
• 4.8 胶乳再生相关部分候选DE-TDFs表达模式的qRT-PCR分析
• 4.8.1 选取胶乳再生相关的部分候选DE-TDFs
• 4.8.2 qRT-PCR分析结果
• 5 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 cDNA-AFLP技术是橡胶树差异表达基因筛选的一种有效手段
• 5.1.2 受割胶调控的基因涉及多个功能类别
• 5.1.3 参与胶乳再生的几个关键代谢途径
• 5.1.4 研究中出现的研究技术问题
• 5.1.5 展望
• 5.2 结论
• 参考文献
• 作者在读硕士期间科研成果简介
• 附录一:有关试剂的配制
• 附录二:缩略词
• 致谢