NR4A1基因调控卵泡膜细胞激素生成的研究

论文摘要

背景和研究目的:多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是生育期妇女常见的内分泌紊乱性疾病,以持续性无排卵和高雄激素的临床表现为特征,其发病机制尚不清楚。在前期研究工作中,我们通过基因芯片杂交技术筛选出正常人和PCOS患者卵巢组织中290个差异表达的基因,NR4A1是该差异表达谱内代表性基因之一,在PCOS患者卵巢中表达下调（正常/PCOS=0.4）。既往大量的研究表明NR4A1在许多重要组织中均有表达,其功能涉及细胞凋亡/增殖、甾体激素代谢、胰岛素抵抗等诸多方面。但是,有关NR4A1在PCOS发生发展过程中的作用尚未见报道。本研究通过构建表达小鼠NR4A1基因的小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）重组腺病毒载体和小鼠NR4A1基因超表达重组腺病毒载体及小鼠卵泡体外培养的方法,实现NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内的表达,观察NR4A1基因干扰和超表达后对卵泡膜细胞雄激素生成相关酶的影响。研究结果为进一步探讨NR4A1在卵泡膜细胞中调节激素生成的作用、以及NR4A1在PCOS高雄激素血征的病理生理机制提供了理论基础。材料与方法: （1）根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒与寡核苷酸进行连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。pShuttle-H1-siRNA,分别将腺病毒骨架质粒pAdeasy-1和穿梭质粒pShuttle- H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组得到重组质粒pAd-H1 -siRNA。然后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。提取重组腺病毒Ad-H1-siRNA感染的小鼠睾丸间质细胞瘤细胞（MLTC-1）蛋白,Western blot检测NR4A1蛋白的表达。（2）用PCR的方法扩增小鼠NR4A1基因全长,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV-NR4A1,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdeasy-1和穿梭质粒pAdTrack-CMV-NR4A1转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组得到重组质粒pAd-CMV-NR4A1。然后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。提取重组腺病毒Ad-CMV-NR4A1感染的AD-293蛋白,Western blot检测NR4A1蛋白的表达。（3）从18～20日龄ICR雌性小鼠卵巢中分离并挑选出直径约200μm左右的卵泡,置于96孔板中进行体外培养3天,每日置显微镜下观察卵泡形态的变化,测量卵泡的直径,更换培养液。应用放射免疫分析法动态测定每天培养液中雌二醇的浓度。（4）分离并挑选出直径约200μm左右的卵泡,培养24小时后挑选形态完整、色泽良好的卵泡,将重组腺病毒Ad-H1-siRNA/NR4A1或Ad-CMV-NR4A1直接加入卵泡培养液中感染卵泡膜细胞。感染卵泡24小时后提取RNA或感染卵泡48小时后提取蛋白,通过Realtime PCR和Western blot的方法验证NR4A1在卵泡膜细胞中的干扰或超表达效果,并检测NR4A1在卵泡膜细胞中被干扰或超表达后对雄激素生成相关酶（StAR,CYP11A1,CYP17A1,HSD3B2）的影响。（5）应用福斯高林（Forskolin,cAMP激动剂）分别处理小鼠卵泡1小时、2小时、4小时、6小时后,Realtime PCR检测NR4A1及雄激素生成相关酶的表达水平。结果:（1）穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经酶切与测序证实构建成功。在此基础上通过BJ-5183细菌内同源重组的方法构建了重组腺病毒质粒pAd-H1-siRNA。重组质粒转染AD-293细胞后经过包装、扩增最终得到高滴度重组腺病毒,重组腺病毒Ad-H1-siRNA/NR4A1感染小鼠睾丸间质细胞瘤细胞（MLTC-1）后显著抑制目的蛋白表达（70%～90%）。（2）穿梭质粒pAdTrack-CMV-NR4A1经双酶切与测序证实构建成功。重组腺病毒Ad-CMV-NR4A1感染的AD-293细胞后,表达小鼠NR4A1蛋白。（3）小鼠窦前卵泡体外培养的3天中,卵泡直径不断增大从最初的200μm增长至320μm～400μm,并且卵泡合成分泌的雌二醇也是伴随着卵泡的生长而增多。（4）重组腺病毒Ad-H1-siRNA/NR4A1感染卵泡膜细胞后,与对照组相比,NR4A1干扰组中NR4A1蛋白的表达水平均降低,两组间差异显著（p<0.05）。并且NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内干扰后明显地抑制了卵泡膜细胞雄激素生成相关酶（StAR,CYP11A1,CYP17A1,HSD3B2）mRNA的表达。重组腺病毒Ad-CMV-NR4A1感染卵泡膜细胞后,与对照组相比,NR4A1超表达组中NR4A1蛋白的表达水平显著升高,两组间差异显著（p<0.05）。并且NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内干扰后明显地促进了卵泡膜细胞雄激素生成相关酶（StAR,CYP11A1,CYP17A1,HSD3B2）mRNA的表达,说明NR4A1与卵泡膜细胞雄激素的生成相关。（5）福斯高林作用后,NR4A1 mRNA表达量迅速升高,1小时达到最高,而雄激素生成相关酶在缓慢升高,在2小时或之后mRNA表达量达到最高。结论:（1）成功构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体Ad-H1-siRNA/NR4A1,并在MLTC-1细胞中验证其抑制NR4A1蛋白表达;成功构建了小鼠NR4A1基因超表达重组腺病毒载体Ad-CMV-NR4A1,为进一步研究NR4A1基因在PCOS中的作用提供了实验基础。（2）建立起小鼠窦前卵泡体外培养模型,该模型为进一步研究与PCOS发病相关的差异基因、蛋白的功能及其作用机制提供了良好的实验平台。（3）NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内干扰后明显地抑制了卵泡膜细胞雄激素生成相关酶（StAR,CYP11A1,CYP17A1,HSD3B2）mRNA的表达;NR4A1基因在小鼠卵泡膜细胞内超表达后明显地促进了卵泡膜细胞雄激素生成相关酶mRNA的表达,说明NR4A1是卵泡膜细胞雄激素生成相关酶的关键调控因素之一。（4）NR4A1可能是一个参与cAMP/PKA信号通路调节卵泡内雄激素生成相关酶表达的转录因子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 小鼠NR4A1 基因siRNA 表达重组腺病毒载体的构建
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 第二部分 小鼠NR4A1 基因超表达重组腺病毒载体的构建
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 第三部分 NR4A1 对小鼠卵泡中卵泡膜细胞激素代谢酶的影响
• 一、材料与方法
• 二、实验结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 综述（一）
• 参考文献
• 综述（二）
• 参考文献
• 攻读学位期间发表文章情况
• 致谢