水稻苯达松和磺酰脲类除草剂抗性基因Bel的载体构建与转化

论文摘要

随着水稻基因组测序计划的完成，以功能基因组学研究为标志的后基因组时代已经到来，近几年来植物功能基因组学发展相当迅速。利用诱变技术获得的水稻苯达松敏感突变体bel，经过精细定位，确定了发生突变的原因是细胞色素P450家族中的CYP81A6起始密码子下游1332bp的地方发生了单碱基G的缺失，使该基因的编码区域发生了移码突变，产生了一个提前终止子。氨基酸序列的改变，造成了细胞色素P450亚铁血红素绑定模体的丢失，而这个模体是细胞色素P450所共有的最具特征性的结构，因此，推测发生了移码突变的基因CYP81A6就是水稻中的抗性基因Bel。本研究就是在此基础上，根据定位结果，克隆了Bel基因，构建植物表达载体，并将该基因分别导入拟南芥、油菜（Brassica napus）、烟草，验证基因功能，研究其表达情况、抗药特性和遗传规律，为培育出抗苯达松和磺酰脲类除草剂的油菜新品种和该基因应用于杂交制种打下基础。主要结果如下：1、提取水稻品种日本晴总RNA，通过RT-PCR，得到基因Bel的ORF片段，其长度为1542bp。将Bel基因克隆到pGEM-T Easy载体，经测序及同源序列比对，确定得到的Bel基因序列与GenBank中的AK104825序列一致。2、以质粒pCAMBIA3301为基础，构建了以bar基因为选择标记的植物表达载体pCAMBIA3301-BEL，其中目的基因Bel替换了原质粒中的GUS基因片段。表达载体经酶切鉴定正确。3、用蘸花的方法转化拟南芥，经Basta筛选得到转化植株32株，PCR检测初步确定目的片段已整合进拟南芥基因组中。4、取转基因拟南芥4株，提取RNA，经RT-PCR检测基因的表达情况，结果表明该基因能正常表达，表型与对照无明显差异。5、对生长3周左右的转基因拟南芥后代进行抗药性试验，对三种除草剂分别设立了浓度梯度，得出了转化株对不同除草剂的有效使用范围，其中苯达松是48％的浓度稀释4000X-16000X，稻无草是0.1g／L-3g／L，Basta是18.5％的浓度稀释167X-10000X，为该基因的实际应用提供了依据。6、用蘸花的方法转化了油菜，通过除草剂筛选出16株转化体，PCR检测初步表明目的基因已整合到油菜基因组。7、用叶盘法转化了烟草，得到31株转化体，PCR检测初步表明目的基因已整合到烟草基因组，还有待进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 1 文献综述
• 1.1 植物基因工程发展概况
• 1.1.1 转基因技术的重要性
• 1.1.2 转基因植物的产业化发展
• 1.1.3 转基因技术发展中存在的问题
• 1.2 植物基因工程与抗除草剂作物
• 1.2.1 抗除草剂基因工程主要方法
• 1.2.2 抗除草剂基因的种类
• 1.2.2.1 抗草丁膦（Glufosinate）基因及其转基因作物
• 1.2.2.2 抗草甘膦（Glyphosate）基因及其转基因作物
• 1.2.2.3 抗除草剂磺酰脲基因及其转基因作物
• 1.2.2.4 其他一些抗除草剂基因及其转基因作物
• 1.2.3 抗除草剂基因的应用
• 1.3 细胞色素P450酶系
• 1.3.1 细胞色素P450的多样性
• 1.3.1.1 细胞色素P450种类多样性
• 1.3.1.2 细胞色素P450功能多样性
• 1.3.2 细胞色素P450代谢除草剂的作用机理
• 1.3.3 细胞色素P450与转基因抗除草剂作物
• 1.3.4 细胞色素P450与除草剂污染的生物修复
• 1.3.5 P450基因在植物改良中的应用
• 1.3.5.1 创造雄性不育系
• 1.3.5.2 培育抗除草剂的作物品种
• 1.3.5.3 生产具有重要医药价值的天然化合物
• 1.3.5.4 改良植物的抗逆性
• 1.4 拟南芥转化方法的概述
• 1.5 油菜与抗除草剂
• 1.6 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植株叶片总RNA提取与RT-PCR
• 2.2.1.1 总RNA抽提步骤
• 2.2.1.2 逆转录反应
• 2.2.1.3 GC含量较高区段的PCR扩增程序
• 2.2.1.4 一步法RT-PCR克隆基因
• 2.2.2 载体的构建
• 2.2.2.1 液体LB（Luria-Bertani）培养基
• 2.2.2.2 小量碱法提取质粒DNA
• 2.2.2.3 电转化感受态细胞的制备
• 2.2.2.4 质粒的酶切
• 2.2.2.5 目标DNA片段的回收纯化
• 2.2.2.6 连接反应
• 2.2.2.7 感受态细胞的电转化
• 2.2.2.8 阳性重组克隆的鉴定
• 2.2.3 抗除草剂基因Bel的遗传转化
• 2.2.3.1 拟南芥的遗传转化
• 2.2.3.2 油菜的遗传转化
• 2.2.3.3 烟草的遗传转化
• 2.2.4 转基因拟南芥种子的筛选与分子检测
• 2.2.4.1 转基因拟南芥种子的筛选
• 2.2.4.2 拟南芥总DNA的提取
• 2.2.4.3 PCR检测
• 2.2.4.4 RT-PCR检测
• 2.2.4.5 转基因植株对除草剂的耐药性试验
• 2.2.5 转基因油菜的筛选与初步检测
• 2.2.5.1 转基因油菜种子的筛选
• 2.2.5.2 PCR检测
• 2.2.6 转基因烟草的初步检测
• 3 结果
• 3.1 目的基因片段的克隆
• 3.2 植物表达载体的构建
• 3.3 转基因拟南芥植株的获得与检测
• 3.3.1 转基因拟南芥植株的获得
• 3.3.2 抗性拟南芥的PCR检测
• 3.3.3 RT-PCR检测
• 3.3.4 转基因拟南芥对除草剂的耐药性试验
• 3.4 转基因油菜的获得与初步检测
• 3.5 转基因烟草的获得与初步检测
• 4 讨论
• 4.1 遗传转化中除草剂筛选浓度的确定
• 4.2 抗除草剂基因遗传表现
• 4.3 抗除草剂基因的应用
• 4.4 除草剂在油菜、烟草中使用时遇到的问题
• 5 参考文献
• 6 致谢