禽流感病毒H5、H7亚型联合RT-PCR的建立

论文摘要

根据GenBank已公布的禽流感病毒H5、H7亚型血凝素蛋白（HA）编码基因,使用DNAStar分析这两个亚型不同毒株间的同源性,选定几个同源性高的区域,之后H5以A/Chicken/Jilinl/hk/2004（H5N1）、H7以A/avian/NY/70411-12/00（H7N2）为参考株,DNAStar来分析两个亚型选定的区域在这两个参考株内的同源性,最后分别确定要扩增的靶区域。严格控制引物自身的二聚体及引物间的二聚体和发卡结构,最后确定了两对引物P51 P52和P71 P72。Trizol法提取RNA,RT-PCR成功扩增出H5、H7的目的基因分别为427bp和228bp。扩增片段与载体pMD18-T连接,将连接产物转化大肠杆菌的感受态细胞,重组质粒经PCR鉴定后进行测序,同时也将PCR产物进行测序。BlastN分析结果显示H5、H7的各自扩增的目的片段扩增产物与GenBank公布的H5、H7亚型血凝素蛋白编码基因同源性在99%～87%之间,从而分子水平上确定建立的RT-PCR反应的特异性。经优化单项RT-PCR,H5亚型51℃～855℃退火温度下扩增效果好,H7亚型55℃情况下扩增效果较好,检出率高,所以二者在55℃下有共同反应程序。模板量为2.0μl时二者的扩增效率高且效果好。H5的合适引物浓度为0.16μM～0.9μM扩增效果好,H7的合适引物浓度在0.32μM～0.96μM时扩增效果好。Mg2+浓度为1.5m M时,两种亚型的扩增效果均较好。最后建立了单项最佳的RT-PCR反应体系组成与反应条件。RT-PCR检测反应的敏感性,结果显示H5的敏感度为10-4,H7的敏感度为10-2。RT-PCR检测猪温病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒及H9亚型禽流感病毒,扩增结果均为阴性。在建立的最适单项RT-PCR反应体系与条件基础之上,确定二联RT-PCR二者合适的引物浓度,H5浓度为0.32μM,H7浓度为0.96μM时二者扩增效果好。二联RT-PCR检测10倍梯度稀释的单项模板,H5的敏感性为10-3,比单项RT-PCR敏感度降低了一个稀释度;H7的敏感性为10-2,与单项RT-PCR敏感度一致。二联RT-PCR检测10倍梯度稀释的H5、H7混合反转录产物,H5的的敏感性为10-3,H7的敏感性10-2,与二联检测单项模板的敏感性一致。实验结果显示建立的二联RT-PCR能够敏感、快速的检测H5和H7亚型禽流感病毒。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1 禽流感病毒概况
• 1.1 禽流感病毒形态、结构与化学组成
• 1.2 禽流感病毒基因组及编码蛋白的功能
• 1.3 禽流感病毒的分型与命名
• 1.4 禽流感病毒的复制（感染）
• 1.5 禽流感病毒的致病性
• 1.6 禽流感病毒的变异
• 1.7 禽流感病毒的抵抗力
• 2 禽流感的主要诊断及检测方法
• 2.1 AIV的分离和初步鉴定
• 2.2 血清学鉴定
• 2.3 禽流感分子生物学诊断技术研究进展
• 3 禽流感的防制
• 第二部分 实验内容
• 实验一 H5 H7单项RT-PCR检测方法的建立及优化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 PCR反应最适条件的确定
• 2.2 其它相关病毒的检测
• 2.3 敏感性实验
• 2.4 特异性试验
• 2.5 单项RT-PCR程序的确定
• 3 讨论
• 3.1 多联PCR引物设计
• 3.2 单项PCR的优化
• 4 小结
• 实验二 H5 H7多联RT-PCR检测方法的建立及优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 合适引物浓度的确定
• 2.2.二联RT-PCR敏感性
• 2.3 多联RT-PCR诊断方法的建立
• 3 讨论
• 3.1 多联PCR引物的设计
• 3.2 二联RT-PCR的优化
• 3.3 敏感性
• 3.4 多联PCR优化组合
• 4 小结
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历