人脐带间充质干细胞向男性生殖细胞分化的研究

论文摘要

生殖健康是当今世界愈来愈受到关注的问题。不孕症的发生率约占育龄夫妇的8%～17%,在不育夫妇中,由男方原因引起者约占40%-50%。而导致男性不育的主要原因是由于生殖干细胞不能增殖和分化为精子。干细胞存在于许多组织中并且能分化为各种类型的细胞,细胞移植来治疗人类疾病已经成为近年来的研究热点。胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞已被证实能够分化为男性生殖细胞,但是它们均面临着伦理、来源、免疫排斥等多方面的问题。而人脐带华尔通氏胶来源的干细胞作为体细胞的一种,不仅具有多种分化潜能,而且移植入体内后具有免疫耐受功能,在组织工程和细胞治疗等方面具有广阔的应用前景。第一部分脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下生殖细胞特性的初步观察目的研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（huMSCs）在精原细胞培养条件下向精原细胞方向分化的潜能。方法采用组织块贴壁法获得huMSCs;取第3代huMSCs分组进行诱导培养:对照组用基本培养液培养,实验组用条件培养液培养。用倒置显微镜和扫描电镜观察对照组和实验组细胞的外部形态差异;透射电镜观察两组细胞内部的超微结构变化;免疫组织化学方法检测两组细胞是否表达精原细胞的标记物CD117及CD49f; Western-blot进一步检测两组细胞表达精原细胞特异性标记物CD49f的情况。结果以人脐带华尔通胶为原料培养获得的贴壁细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记,并可以维持在未分化状态稳定生长、增殖;实验组细胞形态发生了明显的变化,由成纤维细胞形变为圆形,并发现极少数变圆的细胞继续分化呈形似蝌蚪状,而对照组细胞形态未发生类似变化,并且对照组和实验组细胞的超微结构也显示了很大的差异;免疫组化证实实验组细胞表达精原细胞的标记CD117、CD49f,而对照组细胞不表达CD49f,CD117弱阳性表达;Western-blot进一步证实:人脐带huMSCs诱导前不表达精原细胞标记CD49f,而诱导后表达CD49f。结论用组织块贴壁法获得的人脐带来源的huMSCs,在精原细胞培养条件下进行诱导培养,不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程,而且能表达精原细胞的特征性标记,证实人脐带来源的huMSCs具有向精原细胞方向分化的潜能。第二部分人脐带间充质干细胞移植小鼠睾丸的研究目的:观察人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（huMSCs）移植于小鼠睾丸的克隆能力及对不育小鼠生殖功能的影响。方法:体外分离、培养、纯化huMSCs;采用腹腔内单次注射白消安的方法构建不育小鼠模型;取第3代huMSCs,分别用Brdu和Hoechst33258标记,显微注射法移植入不育小鼠睾丸的曲细精管内;采取免疫组化和快速冰冻切片荧光显微镜下观察的方法来检测移植细胞的存活情况;采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统测量小鼠睾丸曲细精管直径。结果:传至3代即可得到数量较多纯化的huMSCs;白消安单次注射可造成25%的小鼠死亡,用药后四周,睾丸的曲细精管仅存基底膜,呈薄的空管状;huMSCs移植于异体小鼠睾丸获得成功,移植后的细胞能够存活至少4个月,并且发生了从管腔到基底膜再到管腔的移行过程;移植后26天与120天,曲细精管直径不育模型移植细胞组较未移植细胞组有所增加,且其差异具有统计学意义。结论:采用曲细精管显微注射法将huMSCs移植于不育小鼠睾丸获得成功,移植后的间充质干细胞能长期存活并发生移行,且能促进不育小鼠生殖功能的恢复。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第1章：实验一 脐带间充质干细胞在精原细胞培养 条件下生殖细胞特性的初步观察
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第2章：实验二 人脐带间充质干细胞移植小鼠睾丸的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 小结
• 致谢
• 个人简介