几种犬呼吸道病毒基因芯片检测方法的建立及初步应用

论文摘要

对犬而言,传染性疾病主要有消化道疾病和呼吸道疾病,而呼吸道疾病是一年四季的常发病,尤其春季、秋季、冬季以及季节交替时候多发,在临床上因其病因复杂,治疗周期长而备受人们关注。而犬呼吸道病毒传染病主要有犬瘟热病毒,犬副流感病毒,犬腺病毒2型,犬呼吸道型冠状病毒。引起犬的共同呼吸道症状：呼吸困难,眼、鼻流出浆液性或黏性分泌物,犬窝咳等。犬呼吸道病毒传染力强,传播速度快,一旦爆发将造成严重的经济损失,所以快速准确检测与鉴定具有重要的临床意义。目前,检测病毒多采用荧光定量ELISA、胶体金试纸条、血凝实验等传统方法[1]。对单一病毒做一对一检测,往往需要制备多种引物或单抗,配备多套检测仪器和试剂,需要检测人员具有丰富的临床知识和掌握多种检测手段,检测效率低。宠物犬、军警犬、导盲犬等发挥越来越重要的社会作用。犬呼吸道病毒的威胁日益严重,需要一种能同时完成上述多种病毒的筛查与鉴定高通量的检测方法。基因芯片技术具有高通量、高度并行性、高速度、高度微型化、高度自动化的优势,将高灵敏度的PCR与高通量的芯片的结合,产生了高效的病原诊断方法。本研究建立了能够同时检测和鉴定犬呼吸道病毒（包括犬瘟热、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬腺病毒2型）的多重PCR基因芯片和随机引物PCR基因芯片检测方法,通过在这些病毒的高度保守区上设计引物和探针,将探针点在醛基玻片上,经过PCR扩增过程将HEX荧光染料标记在产物上,PCR产物与芯片杂交,利用扫描仪进行分析。多重PCR基因芯片验证了探针的灵敏度、特异性,在此基础上,建立了用于鉴定几种犬呼吸道病毒随机引物PCR基因芯片检测方法并进行了初步应用。本实验主要完成了以下三部分工作：一、犬呼吸道病毒特异性寡核苷酸探针的设计及验证从NCBI网站上的genome数据库下载犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬2型腺病毒基因组序列,从该网站的oligonucleotide数据库下载上述病毒的各病毒株部分序列或全序列。每种病毒的下载序列分别比对后得到种特异性病毒保守区,在各自保守区内以Primer Premier5.0软件设计种特异性寡核苷酸探针及对应的PCR引物。遵循探针的设计原则,使所有探针尽量具有相近的杂交动力学参数。利用生物信息学技术,通过与所有公开发表的病毒序列进行比较,进行了病毒保守区和寡核苷酸探针的特异性验证,包括病毒属内序列同源性、种间序列的特异性、种内毒株的保守性。经过筛选与验证,确定了4条犬呼吸道病毒特异性鉴定短寡核苷酸探针。二、犬呼吸道病毒多重PCR基因芯片检测方法的建立根据上述实验得到的各病毒种保守区,分别设计犬呼吸道病毒各病毒多重PCR扩增引物,上游引物的5＇端标记HEX荧光染料。优化各病毒引物比例,建立了犬呼吸道病毒多重PCR扩增方法。以细胞毒和病料的核酸提取物为模板,验证了该多重PCR方法的特异性。试验结果显示,所建立的多重PCR反应体系对犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒、犬2型腺病毒等均能扩增出特异的目的条带,而对狂犬病毒、小反刍兽疫病毒等呈阴性。探针用MG2-610型点样仪通过机械手臂分别以夹缝针接触式点样方式印迹于醛基玻片上,探针浓度为30μmol/μl,点样温度为25℃,点样湿度为70%,点样后经NaBH4封闭。经优化杂交条件,建立了犬呼吸道病毒基因芯片检测方法。基因芯片的特异性良好,灵敏度能达到0.1个TCID50。检测灵敏度是PCR方法100倍。分别使用同一批次和不同批次的多张芯片检测犬瘟热病毒,结果均为阳性,证明本芯片具有良好的重复性。制备的基因芯片放置1年以上仍然具有良好的检测特异性。三、犬呼吸道病毒随机引物扩增基因检测芯片的建立采用两条随机引物PrimerA和PrimerB,反转录时使用PrimerA, PCR体系使用PrimerB。这种方法经试验只针对三种呼吸道RNA病毒。PCR过程中退火温度设置为50℃,扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,为200bp-2000bp的条带集合,与基因芯片杂交后在芯片相应探针处出现阳性信号。随机引物PCR基因芯片的灵敏度为1个TCID50,特异性好,稳定性高。总之,本实验设计了4条犬呼吸道病毒特异性寡核苷酸探针,并验证了寡核苷酸探针的特异性,制备成低密度基因芯片。在探针所在保守区设计PCR扩增引物,建立了4种犬呼吸道病毒多重PCR扩增方法,在此基础上,建立了3种犬呼吸道病毒随机PCR扩增基因检测芯片的方法。应用该技术,可对细胞培养上清及临床病料中主要的犬呼吸道病毒进行快速筛查。在出现传染病疫情时,结合临床症状及流行病学特征等,可在基因水平上快速鉴定是否为犬呼吸道病毒。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第一篇 文献综述
• 1 呼吸道病毒概述
• 1.1 犬瘟热病毒
• 1.2 犬腺病毒
• 1.3 犬副流感病毒
• 1.4 犬冠状病毒
• 2 芯片技术简述
• 2.1 芯片技术的优势
• 2.2 芯片技术的类型
• 2.2.1 点样芯片（Spotted DNA arrays）
• 2.2.2 原位合成芯片（Oligonucleotide arrays）
• 2.3 芯片技术操作步骤
• 2.4 芯片数据的分析和解释
• 3 芯片技术在病原体研究中的应用
• 3.1 微生物检测
• 3.2 未知病原体的筛查
• 3.3 疫苗研制
• 3.4 流行病学调查
• 3.5 历史回顾性调查
• 3.6 微生物进化
• 4 基因芯片的新方法
• 4.1 纳米技术与芯片
• 4.2 半导体基础的光电二级管生物芯片
• 4.3 芯片实验室
• 5 结语
• 第二篇 实验研究
• 第1章 犬呼吸道病毒寡核苷酸探针的设计及验证
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 犬呼吸道病毒基因序列的下载
• 2.2 犬呼吸道病毒基因组序列的比对
• 2.3 犬呼吸道病毒特异性探针的设计
• 2.4 探针的筛选和特异性生物学验证
• 3 结果
• 3.1 犬呼吸道病毒基因序列下载
• 3.2 犬呼吸道病毒基因组保守区比对
• 3.3 犬呼吸道病毒各病毒种保守性探针设计结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第2章 犬呼吸道病毒多重PCR基因芯片检测方法的建立
• 1 材料
• 1.1 病毒株及细胞株
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 其它材料
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 核酸提取—使用SPIN技术从动物细胞中纯化总RNA
• 2.3 逆转录
• 2.4 DNA的提取
• 2.5 PCR扩增
• 2.6 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.7 测序
• 2.8 多重PCR扩增方法的建立
• 3 基因芯片制备
• 3.1 基因芯片点样模式
• 3.2 点样后芯片的后处理
• 3.3 芯片的杂交
• 3.4 结果扫描及分析
• 3.5 单一病毒样品多重PCR-基因芯片检测
• 3.6 基因芯片检测特异性验证
• 3.7 基因芯片检测灵敏度验证
• 3.8 基因芯片稳定性验证
• 3.9 基因芯片探针稳定性验证
• 3.10 临床样本的验证
• 4 结果
• 4.1 犬呼吸道病毒多重PCR扩增结果
• 4.2 多重PCR体系扩增特异性验证结果
• 4.3 犬呼吸道病毒多重PCR体系扩增灵敏度验证结果
• 4.4 犬呼吸道病毒多重PCR扩增体系重复性结果
• 4.5 生物公司测序结果
• 4.6 单病毒基因芯片检测结果
• 4.7 基因芯片检测特异性验证
• 4.8 基因芯片检测灵敏度验证
• 4.9 基因芯片稳定性验证
• 4.10 基因芯片探针稳定性验证
• 4.11 临床样本的验证
• 5 讨论
• 6 小结
• 第3章 犬呼吸道病毒随机引物PCR基因芯片的建立
• 1 材料
• 1.1. 病毒株与细胞株
• 1.2 PCR试剂与仪器
• 1.3 其它材料
• 2. 方法
• 2.1 核酸提取
• 2.2 反转录
• 2.3 样本cDNA进行随机引物PCR扩增
• 2.4 芯片的洗涤
• 2.5 芯片扫描分析
• 2.6 PCR产物与芯片杂交条件的优化
• 2.7 随机引物PCR基因芯片特异性实验
• 2.8 随机引物PCR基因芯片灵敏度实验
• 2.9 随机引物PCR基因芯片应用
• 3 结果
• 3.1 随机引物扩增结果
• 3.2 PCR产物与芯片杂交条件的优化
• 3.3 随机引物PCR基因芯片特异性验证
• 3.4 随机引物PCR基因芯片灵敏度的验证结果
• 3.5 随机引物PCR基因芯片的应用
• 4 讨论
• 5 小结
• 总结
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢