论文摘要
目的:1.构建携带人激肽释放酶（kallikrein,KK）基因的重组腺相关病毒载体,测定其感染滴度。2. 体外培养人脐静脉内皮细胞（human vein endothelial cell,HUVEC）,将KK 基因以病毒感染的形式导入HUVEC,观察其对一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）水平和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表达的影响,并对比观察依那普利（Enalapril）对NO、ET-1 和eNOS 影响。方法:1.将KK 基因定向克隆入腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS 中构建成pAAV-KK。2.分别将pAAV-KK（目的基因）及pAAV-LacZ（报告基因）与另外两种质粒pHelper、pAAV-RC 通过脂质体共转染AAV-293 细胞,包装出带有KK 目的基因的重组腺相关病毒载体和带有LacZ 报告基因的重组腺相关病毒载体,收集两种重组病毒颗粒原液。将带有LacZ 报告基因的重组腺相关病毒颗粒原液稀释成不同浓度梯度并感染HT-1080 细胞,通过β-半乳糖苷酶染色测定病毒感染滴度。3. 将带有LacZ 报告基因的重组腺相关病毒以最佳浓度感染HT-1080 细胞,传代并染色,观察报告基因在HT-1080 细胞的表达情况。4. 将带有KK 目的基因的重组腺相关病毒以最佳浓度感染HUVEC,检测其对NO、ET-1 水平和eNOS 基因表达的影响,并对比观察依那普利对NO、ET-1 和eNOS的影响。结果:1.成功构建了带有KK目的基因的重组腺相关病毒载体和带有LacZ报告基因的重组腺相关病毒载体。2.籍β-半乳糖苷酶原位染色法检测报告基因LacZ在HT-1080细胞中的表达测得重组病毒感染滴度为6.2×107IU/ml。3. rAAV-LacZ重组病毒感染HT-1080细胞后,LacZ基因能够在连续传代的HT-1080细胞内稳定持续表达。4.与对照组及空白组相比,KK感染组及依那普利组的HUVEC细胞培养液中NO水平增加（KK组:21.29±1.465μmol/L,依那普利组:18.24±0.836μmol/L,空白组:16.42±1.028μmol/L,LacZ对照组:16.47±1.251μmol/L;P<0.01）,ET-1水平下降（KK组:199.48±16.99 pg/ml,依那普利组:220.29±12.18 pg/ml,空白组:262.91±17.85pg/ml,LacZ对照组:263.57±15.86 pg/ml;P<0.01）及eNOS基因表达增强（KK重组病毒组:0.42329±0.038,依钠普利组:0.40657±0.033,空白组:0.35329±0.031,LacZ对照组:0.36488±0.049;P<0.01）;与其他三组相比,
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