C4型PEPC基因导入油菜的研究

论文摘要

高等植物按碳的同化反应不同可分为C3、C4和CAM类型。C4植物在长期的进化过程中形成了特有的光合相关基因，使得C4植物在高光强、高温和高氧分压条件下具有较C3植物更高的光合速率。利用转基因技术，将C4光合相关基因导入C3植物，以提高光合效率来达到提高作物产量，是主要农作物育种研究的一个热点。本研究利用下胚轴侵染和花序浸染两种方法来将农杆菌介导的玉米C4型PEPC光合相关基因导入到甘蓝型油菜中，为利用C4高光效基因提高油菜产量和品质作出初步探索。。在下胚轴侵染方法中，对影响遗传转化的一些关键因素进行了研究。结果表明，当预培养2d，激素为1.5mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA，分化激素为4mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3时，愈伤组织诱导率达到最大，愈伤组织质量最好。加了GA3愈伤容易形成白色致密组织，不易分化。NAA和6-BA比例过高，容易造成根的分化而抑制芽的分化。在OD600为0.3-0.5的菌液中浸染30s，卡那霉素由第一次筛选浓度5mg/L逐渐提高到有10mg/L，出现绿色的抗性愈伤组织最多。将愈伤组织继代，并转入分化培养基，得到抗性苗，将抗性苗转入生根培养基，获得可能的转基因植株六株。最后通过分子标记法检测到两株转基因植株。在花序浸染方法中，在适宜条件下，将农杆菌浸染液中加入0.05%表面活性剂Silwet-77，一周内每隔一天处理一次花序，结实率较高，当Silwet-77浓度高于0.1%，后代结实率下降，且没有得到转基因植株。将收获的种子分别采取浸种法和叶片喷雾法进行卡那霉素抗性筛选，而大田种植的植株以卡那霉素浓度为350mg/L进行叶片喷雾法，连续喷洒3-4天进行筛选。经过初步筛选的植株再通过分子标记检测共获得五株转基因植株。将获得的七株转PEPC基因油菜进行PEPC酶活性和净光合速率的测定，结果显示转PEPC基因油菜的PEPC酶平均活性比原种提高了17倍左右，净光合速率比原种提高了15.5%，胞间CO2浓度比原种低35%，这表明PEPC基因在转油菜植株中得到了高效表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1.文献综述
• 1.1. 转基因技术改良油菜
• 1.2 油菜的遗传转化方法
• 4光合途径特征及其在作物育种中的应用'>1.3 C₄光合途径特征及其在作物育种中的应用
• 4光合固碳相关基因植物的光合生理特性'>1.4 转 C₄光合固碳相关基因植物的光合生理特性
• 2.引言
• 3.材料与方法
• 3.1 PEPC 基因的生物信息学分析
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 PEPC 基因导入油菜
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 质粒和菌株
• 3.2.3 培养基
• 3.3 下胚轴浸染法将 PEPC 基因导入油菜
• 3.3.1 油菜愈伤组织的诱导
• 3.3.2 农杆菌与下胚轴的共培养
• 3.3.3 抗性愈伤组织的筛选及幼苗培育
• 3.4 F loral - dip 法将 PEPC 基因导入油菜
• 3.4.1 浸染液的制备
• 3.4.2 油菜的转化
• 3.4.3 转化后代的抗性筛选
• 3.5 转基因油菜的鉴定和生化指标测定
• 3.5.1 转 PEPC 基因油菜的分子标记检测
• 3.5.2 转 PEPC 基因油菜 PEPC 酶活的测定
• 3.5.3 转 PEPC 基因油菜光合的测定
• 4.结果与分析
• 3、 C₄型 PEPC 的生物信息学分析'>4.1 C₃、 C₄型 PEPC 的生物信息学分析
• 4.1.1 PEPC 一级结构分析
• 4.1.2 PEPC 二级结构分析
• 4.1.3 PEPC 氨基酸序列结构域功能的分析
• 4.1.4 PEPC 的三级结构预测
• 4.2 PEPC 基因导入油菜
• 4.2.1 激素对油菜愈伤诱导的影响
• 4.2.2 预培养时间对油菜愈伤形成的影响
• 4.2.3 抗生素对愈伤组织组织分化的影响
• 4.3 Floral - dip 法将 PEPC 基因导入油菜
• 4.3.1 转化缓冲液成分对 floral - dip 法效率的影响
• 4.3.2 浸种法筛选转 PEPC 基因油菜
• 4.3.3 叶片涂抹法筛选转 PEPC 基因油菜
• 4.4 转 PEPC 基因油菜的鉴定和生化变化
• 4.4.1 转 PEPC 基因油菜的分子标记筛选
• 4.4.2 转 PEPC 基因油菜的 PEPC 酶活性变化
• 4.4.3 转 PEPC 基因油菜光合效率的变化
• 5.讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 研究生期间发表论文