利用唐鱼卵黄蛋白原作为生物标志物检测环境内分泌干扰物的研究

论文摘要

环境内分泌干扰物（EDCs）对人类和野生动物的有害效应已经引起了人们的广泛关注。近年来，包括实验室内及野外实验的结果都表明，检测水生动物体内卵黄蛋白原的诱导产生是筛选EDCs以及评价水生动物暴露于其中的潜在风险的有用工具。唐鱼是广州特有的鱼种，具有饲养要求低，病害少，管理条件简单；产卵量大，可连续产卵；繁殖周期短；雌雄异体，性成熟后易区分性别；卵膜通透，易于胚胎发育观察等优点。作为对生存环境要求极高的鱼种，唐鱼对外源性激素类物质十分敏感，已被认为是检测环境雌激素的理想实验动物。但是迄今尚未见以唐鱼作为实验动物进行EDCs研究的报道。本研究旨在通过分离纯化唐鱼卵黄脂磷蛋白（Lv）作为抗原制备抗血清；人工诱导雄性唐鱼产生卵黄蛋白原（Vtg），并将其提取纯化；用免疫印迹检测唐鱼Vtg与Lv之间是否具有相同免疫原性；从而以Lv抗血清为抗体，Lv为标准品建立测定唐鱼体内Vtg含量的间接酶联免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法；最后应用该法检测经滴滴涕（DDTs）暴露处理的雄性唐鱼体内的Vtg含量，以探究DDTs的雌激素效应，以及证实唐鱼是否适合作为检测环境雌激素的理想实验动物，为今后把唐鱼培育成监测环境污染物的指示生物奠定基础。采用Native-PAGE和SDS-PAGE方法从性成熟雌性唐鱼（Tanichthys albonubes）卵巢组织提纯了卵黄脂磷蛋白（Lv）。已确定被纯化的唐鱼Lv在Native—PAGE（4-7.5％）电泳中分子量为314kD，蛋白条带分别可被苏丹黑B、高碘酸-Shiff试剂、甲基绿染色，证明唐鱼Lv是一种富含糖、脂、磷的蛋白质。用纯化的唐鱼Lv免疫大白鼠获得鼠源多克隆抗血清。以Native-PAGE和SDS-PAGE制备的唐鱼Lv及裂解后的组分作为抗原所制备的抗血清与经17β-雌二醇（E2）诱导的雄性唐鱼、去除卵巢的雌性唐鱼以及唐鱼卵巢的匀浆液能发生免疫反应，并且印迹位置与雌性特异蛋白卵黄蛋白原（Vtg）的位置相当。但是两种血清和未经E2诱导的雄鱼整体匀浆液并无反应，显示Lv及其98kDa大分子亚基的抗血清与Vtg和Lv两种蛋白是特异结合的。结果表明，唐鱼Lv裂解组分的抗血清可用于检测唐鱼的Vtg。以Native-PAGE分析经过浓度为50μg／L E2诱导的雄性唐鱼整体匀浆液，结果表明，雄性唐鱼产生了雌性特异蛋白Vtg，并且在体内积累。利用Mg2+-EDTA选择性沉淀和Q Sepharose阴离子交换层析的两步纯化方法可以分离纯化唐鱼Vtg。经Native-PAGE鉴定，唐鱼Vtg的分子量为440kDa。以唐鱼Lv抗血清为抗体，Lv作为标准品建立间接酶联免疫吸附（ELISA）方法，可用于检测整体匀浆中Vtg的含量。该方法的检测工作范围为3.26～209.25ng／mL，Lv抗血清最佳稀释度为1：3200，批内误差为8.59％，批间误差为6.28％，灵敏度为8.1ng／mL。在此范围内，标准曲线具有良好的线性和重复性。运用该方法检测经过不同浓度DDTs暴露20d的雄性唐鱼体内的Vtg含量。结果表明，在低浓度DDTs作用下，可以诱导雄性唐鱼产生Vtg。当暴露DDTs浓度为0.0275mg／mL、0.0137mg／mL和0.0067mg／mL时，雄性唐鱼体内Vtg含量分别为1109.43μg／g、911.16μg／g和1322.79μg／g，与溶剂对照组462.79μg／g存在显著差异（p＜0.05）。证明DDTs具有雌激素性质，也表明唐鱼卵黄蛋白原适合作为监测环境EDCs的理想生物标志物。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 环境内分泌干扰物研究进展
• 1.1 环境内分泌干扰物
• 1.2 EDCs的来源及分类
• 1.3 EDCs的危害及其作用机理
• 1.4 我国环境内分泌干扰物的污染现状
• 2 EDCs生物标志物的研究进展
• 2.1 生物标志物
• 2.2 环境雌激素的生物标志物
• 3 关于卵黄蛋白原
• 3.1 Vtg的合成方式
• 3.2 Vtg的结构特性
• 3.3 Vtg的检测方法
• 4 Vtg作为 EDCs生物标志物在水环境检测中的应用
• 4.1 体外实验
• 4.2 体内实验
• 4.3 野外实验
• 5 唐鱼的研究背景
• 6 本研究的目的和意义
• 7 本文的研究路线
• 第一章 唐鱼卵黄脂磷蛋白的纯化鉴定及免疫原性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 试剂配制
• 1.3 实验动物
• 1.4 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 唐鱼 Lv的 PAGE分析
• 2.2 唐鱼 Lv的纯化
• 2.3 免疫印迹分析
• 2.4 Lv98kDa大分子亚基抗血清的特异性分析
• 3 讨论
• 3.1 唐鱼 Lv的结构
• 3.2 唐鱼 Lv的纯化
• 3.3 唐鱼 Lv抗体免疫原性的意义
• 4 结论
• 第二章 唐鱼卵黄蛋白原的诱导、纯化与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 试剂配制
• 1.3 实验鱼
• 1.4 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 唐鱼 Vtg的诱导
• 2.2 唐鱼 Vtg纯化结果
• 3 讨论
• 3.1 唐鱼Vtg的结构
• 2对唐鱼Vtg的诱导作用'>3.2 E₂对唐鱼Vtg的诱导作用
• 3.3 唐鱼Vtg的提取和纯化方法
• 4 结论
• 第三章 唐鱼卵黄蛋白原的 ELISA检测
• 1 材料与方法
• 1.1 药品及仪器
• 1.2 试剂的配制
• 1.3 实验方法
• 2 结果
• 2.1 抗血清和包被抗原最佳工作浓度
• 2.2 Lv标准曲线
• 2.3 质量控制
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 以唐鱼 Vtg为生物标志物检测 DDTs的雌激素效应
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 实验鱼
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢