幽门螺杆菌对CD4+CD25+调节性T细胞的影响及意义的研究

论文摘要

背景和目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）逃逸宿主的免疫清除,长期定植在胃黏膜引起慢性持续性感染的机制目前尚不清楚。调节性T细胞（Regulatory T Cells, Treg）是一类具有免疫调节功能的T细胞群体,主要发挥免疫抑制作用,在多种免疫性疾病中起重要作用。近年来研究表明Treg在H. pylori逃逸宿主免疫清除及调节H. pylori感染所致炎症反应中起一定作用。为此本研究在体内外观察了H. pylori对CD4+CD25+Foxp3+Treg的影响,以期从CD4+CD25+Treg的角度探讨H. pylori致病机制,为后续以CD4+CD25+Treg为靶点防治H. pylori感染和H. pylori相关性疾病提供理论和实验依据。方法:⑴患者及标本:239例胃镜活检的胃黏膜,其中非萎缩性胃炎（CNAG）75例（H. pylori阳性50例,H. pylori阴性25例）,萎缩性胃炎（CAG）24例（H. pylori阳性13例,H. pylori阴性11例）,肠化与异型增生（IM+DYS）90例（H. pylori阳性45例,H. pylori阴性45例）,胃癌50例（H. pylori阳性15例, H. pylori阴性35例）。⑵小鼠H. pylori感染模型建立和根除治疗:6-8周龄的清洁级的BALB/c小鼠,给予含1.0×109/ml的SS1 H. pylori活菌液,0.5ml/只,灌胃,隔日一次,共5次。建立动物模型后,随机分为4组:①感染组:仅给予药物赋形剂5%阿拉伯树胶溶液;②治疗组1:阿莫西林（AM）+5%阿拉伯树胶溶液;③治疗组2:AM+奥美拉唑（OM）+5%阿拉伯树胶溶液;④治疗组3:AM+OM+壳聚糖+5%阿拉伯树胶溶液,每组10只;分别给予上述药物每日2次灌胃,共2周。另设一正常对照组不给予H. pylori和任何药物。停药后4周,处死小鼠,取标本待测。⑶H. pylori与小鼠脾淋巴细胞共培养:以不同浓度的SS1 H. pylori活菌（0 CFU/ml、0.50×107CFU/ml、1.00×107CFU/ml、2.00×107CFU/ml、4.00×107CFU/ml）与原代分离的BALB/c小鼠脾淋巴细胞共培养,分别在3h、6h、12h和24h点收集细胞。⑷各项指标检测:①胃黏膜内H. pylori的检测:采用改良Giemsa染色和H.pylori定量培养法检测;②血清抗H. pylori CagA-IgG检测:采用间接ELISA法;③小鼠淋巴细胞和胃黏膜内Foxp3 mRNA检测:采用RT-PCR方法检测;④胃黏膜内Foxp3蛋白的检测:采用二步法免疫组织化学染色法检测;⑤CD4+CD25+Treg检测:采用流式细胞术检测。研究结果:⑴H. pylori感染和根除对胃黏膜内Foxp3表达的影响:①在各疾病组患者,H. pylori阳性患者胃黏膜内Foxp3表达显著高于H. pylori阴性者（P<0.001,0.01）,胃癌组Foxp3的表达显著高于CNAG、CAG和IM+DYS组患者（P<0.001,0.005）;CagA阳性和阴性H. pylori菌株感染者胃黏膜内Foxp3阳性细胞百分比无显著差异（P>0.05）。②在小鼠H. pylori感染模型中,H. pylori感染小鼠胃黏膜内Foxp3 mRNA表达和其阳性细胞百分比均显著高于正常未感染小鼠（P<0.001）;而H. pylori根除后小鼠胃黏膜内Foxp3 mRNA表达和其阳性细胞百分比显著下降,显著低于H. pylori感染小鼠和H. pylori未根除小鼠（P<0.001）,与正常小鼠无差异（P>0.05）,同一治疗组中H. pylori根除小鼠胃黏膜内Foxp3 mRNA表达和其阳性细胞百分比均显著低于与未根除小鼠（P<0.001）。⑵H. pylori对小鼠脾淋巴细胞CD4+CD25+Treg的影响:①H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞3h、6h和12h后对小鼠淋巴细胞内Foxp3 mRNA的表达无显著影响（P>0.05）;在24h时不同浓度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞可显著降低其Foxp3 mRNA的表达,并呈浓度依赖性（P<0.001）,随着H. pylori活菌浓度增加,Foxp3 mRNA的表达逐渐降低,各浓度组均显著低于对照组（P<0.001,0.05）,2.00×107CFU/ml组显著低0.50×107CFU/ml组（P<0.05）;4.00×107CFU/ml组显著低于其他各浓度组（P<0.001）。②流式细胞仪检测表明,H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞6h和12h后CD4+CD25+Treg细胞百分比无显著变化（P>0.05）;在24h时,不同浓度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞可显著降低CD4+CD25+Treg细胞百分比,并呈浓度依赖性（P<0.05）,随着H. pylori活菌浓度增加,CD4+CD25+Treg细胞百分比下降,4.00×107CFU/ml浓度组显著低于对照组（P<0.01）、0.50×107CFU/ml浓度组（P<0.05）和1.00×107CFU/ml浓度组（P<0.01）。结论:（1）H. pylori定植于胃黏膜可显著增加胃黏膜内Foxp3+Treg的数量,从而有利于其逃避宿主免疫清除,这可能是H. pylori在体内形成慢性持续感染的重要原因。⑵无论是H. pylori阴性还是阳性的胃癌患者,其胃黏膜内Foxp3阳性细胞数显著增加,提示在胃癌患者存在免疫抑制现象。⑶H. pylori根除小鼠胃黏膜内CD4+CD25+Foxp3+Treg显著减少,它的减少是继发于H. pylori根除后,还是小鼠胃黏膜局部的CD4+CD25+Foxp3+Treg少从而有利于H. pylori的根除,这有待进一步研究。⑷H. pylori菌在体外可下调小鼠淋巴细胞Foxp3 mRNA的表达及减少CD4+CD25+Treg数量,提示H. pylori菌直接与淋巴细胞作用,可抑制淋巴细胞分化为Treg,这与其在体内的作用不同,这可能是H. pylori自然感染和H. pylori疫苗接种后诱导不同免疫反应的机制之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 第二章 H.pylori 感染和根除对胃黏膜内 Foxp3 表达的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 H. pylori 感染及其相关性疾病患者胃黏膜内 Foxp3 的表达
• 2.1.2 小鼠 H. pylori 感染和根除后胃黏膜内 Foxp3 表达
• 2.1.3 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 H. pylori 感染及其相关性疾病患者胃黏膜内Foxp3 的表达
• 2.2.2 小鼠H. pylori 感染和根除后胃黏膜内Foxp3 的表达
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• +CD25⁺Treg 的影响'>第三章 H.pylori 对小鼠脾淋巴细胞 CD4⁺CD25⁺Treg 的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 H. pylori 活菌对小鼠淋巴细胞内Foxp3 mRNA 表达的影响
• +CD25⁺ Treg 变化'>3.2.2 H. pylori 活菌作用后小鼠淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺ Treg 变化
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录 综述
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果