大白菜PHK4基因的克隆和序列分析

论文摘要

在生物周期的各个阶段中,植物活体细胞需要不断地对细胞内外的各种刺激如激素、化学物质、光照、温度和微生物等做出应答。组氨酸激酶在高等植物中广泛存在,是双组分信号系统的重要元件。在拟南芥的细胞分裂素信号转导通路中,组氨酸激酶作为受体分子与细胞分裂素结合后,组氨酸激酶在ATP供能下自身磷酸化,然后通过含有组氨酸基团的磷酸转移蛋白将磷酸基团传递给反应调节器,从而调节基因表达,引起细胞应答反应。本论文采用反向PCR和基因组步移等方法从大白菜中克隆到PHK4 (Pekinensis putative histidine kinase 4)包括基因编码区全长的DNA序列,其长度为8474 bp。PHK4与拟南芥AHK4是同源基因。序列比对表明二者的基因编码序列相似性达到80%,氨基酸序列相似性达到91%。通过生物信息学的方法对其功能进行初步分析,结果表明PHK4含有组氨酸激酶的四个保守结构域:细胞分裂素的识别位点和结合域CHASE区;传递域上组氨酸激酶二聚化位点和磷酸受体结合域HisKA;传递域上类似于组氨酸激酶的ATP酶;组氨酸激酶磷酸化结构域以及接受来自感受器信号的REC区。进化树分析显示PHK4与AHK4,AHK2,AHK3的进化关系较近,保守的氨基酸位点完整。我们初步推测PHK4是组氨酸激酶,在大白菜细胞信号转导通路中作为细胞分裂素受体发挥作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 双组分信号系统概述
• 1.2 高等植物的双组分信号系统
• 1.2.1 细胞分裂素信号途径
• 1.2.2 乙烯信号转导通路
• 1.2.3 光敏色素的光信号转导
• 1.2.4 渗透调节途径
• 1.3 蛋白激酶研究概述
• 1.4 实验目的意义
• 1.4.1 PHK4 基因克隆
• 1.4.2 PHK4 基因的序列分析
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器与试剂
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂与药品
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 播种大白菜A-81 和拟南芥C 型野生型
• 2.3.2 CTAB 法提取植物基因组DNA
• 2.3.3 反向PCR 扩增
• 2.3.4 PCR 产物的回收
• 2.3.5 连接反应
• 2.3.6 转化
• 2.3.7 重组克隆的检测
• 2.3.8 测序
• 2.3.9 RNA 的提取及纯度检测
• 2.3.10 反转录及PCR 扩增
• 2.3.11 染色体步移实验
• 2.3.12 利用生物信息学对PHK4 基因的编码蛋白进行功能分析
• 2.3.13 进化树分析
• 第三章 PHK4 基因的克隆
• 3.1 PHK4 基因1815 序列的获得
• 3.1.1 选取的已知序列
• 3.1.2 从已知序列上设计引物进行反向PCR 扩增
• 3.1.3 测序结果分析
• 3.2 PHK4 基因1056 序列的获得
• 3.2.1 实验操作
• 3.2.2 测序结果2871 序列分析
• 3.3 PHK4 基因1973 序列获得
• 3.3.1 从已知序列上设计引物进行反向PCR 扩增
• 3.3.2 测序结果1973 bp 序列分析
• 3.4 PHK4 基因2627 序列的获得
• 3.4.1 染色体步移方法获得5’端部分序列
• 3.4.2 常规PCR 验证测序结果
• 3.5 PHK4 基因3148 序列的获得
• 3.5.1 目的片段克隆
• 3.5.2 测序结果
• 3.6 PHK4 基因3008 序列的获得
• 3.6.1 利用PCR 扩增目的片段
• 3.6.2 测序结果
• 3.7 PHK4 基因8474 序列
• 3.8 反转录PCR 结果
• 3.8.1 RNA 提取和反转录结果
• 3.8.2 RT-PCR 结果
• 3.8.3 3’RACE 扩增
• 第四章 生物信息学分析
• 4.1 编码序列分析
• 4.2 序列相似性分析
• 4.3 保守结构域的分析
• 4.3.1 CHASE 区
• 4.3.2 传递结构域
• 4.3.3 REC 区
• 4.4 进化树分析
• 第五章 讨论和结论
• 5.1 未知基因的获得方法比较
• 5.1.1 反向PCR 扩增
• 5.1.2 染色体步移法
• 5.1.3 基因编码区的获得
• 5.2 保守结构域分析
• 5.3 细胞分裂素受体基因
• 5.4 PHK4 基因与细胞分裂素信号通路的关系
• 参考文献
• 缩略语表
• 致谢