一个新的家蚕免疫相关蛋白基因与多角体蛋白基因的融合表达及其功能的初步研究

论文摘要

杆状病毒在极晚期基因表达过程中,产生两种高效表达的蛋白,它们是多角体（Polh）蛋白和P10蛋白,其中多角体蛋白是形成多角体的主要成分,基因序列大小为738 bp,编码246个氨基酸残基,分子量大小为29 kD,多角体启动子是高效启动子,因此多角体蛋白的表达量很高。感染后期在细胞中的积累可高达30%-50%,形成晶体结构,称为多角体,这种多角体晶体经过低速离心即可沉淀下来,并且它在碱性条件下能溶解。这些独特的性质对于多角体蛋白融合表达与纯化外源蛋白是非常有利的。基于多角体的以上特性,从本实验室构建的家蚕cDNA文库中获得一个新的编码家蚕免疫相关蛋白（immune-related protein）的基因,将其命名为BmIRP（GenBank:NM001098349.1）该基因全长为775 bp, ORF大小为516 bp,编码172个氨基酸残基,预测分子量为18.4 kD,将BmIRP与多角体基因（Polh）融合,中间连上一个TEV酶切位点,克隆到融合表达载体pET-28a相应的酶切位点,构建了重组pET-28a-Polh-BmIRP,将重组质粒转入E.coli BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE 及Western blotting鉴定发现一条特异性条带,与重组pET-28a-BmIRP相比,融合多角体基因表达量明显提高。表达出来的多角体融合蛋白形成了多角体结构,具有与天然多角体一样的特性,在pH 11.0的条件下能大量溶解,当pH值调至7.4左右,融合蛋白又沉淀下来,通过不同pH值的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液进行梯度洗涤融合蛋白,即可纯化融合蛋白,纯度达92%。经MALDI-TOF-MS鉴定纯化的蛋白为Polh-BmIRP融合蛋白,在扫描电镜下观察,融合蛋白呈现出与天然多角体相同的多面体结构。同时,尝试利用Bac-to-Bac家蚕杆状病毒表达系统高效表达融合蛋白,在家蚕BmN细胞中成功表达了该融合蛋白。这种融合表达方式可用来高效表达外源基因及简便地纯化目的蛋白。对BmIRP蛋白进行生物信息学分析、结晶条件的初步探索、RNAi研究及组织转录水平分析,为今后研究该蛋白的结构与功能奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述与实验设计
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1 杆状病毒多角体蛋白概述
• 2 杆状病毒表达系统研究进展
• 3 Reeler保守结构域
• 3.1 Reeler保守结构域介绍
• 3.2 Reelin信号转导通路
• 4 研究现状和展望
• 第二章 实验方案设计
• 1 研究的目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程
• 3.1 家蚕BmIRP蛋白融合多角体原核表达与纯化
• 3.2 BmIRP基因融合Polh基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
• 3.4 基因干扰技术对BmIRP功能的初步研究
• 3.5 BmIRP基因在家蚕组织中的转录差异分析
• 第二部分 研究内容
• 第三章 生物信息学分析
• 1 生物信息学工具
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 家蚕BmIRP基因序列
• 3.2 保守结构域分析
• 3.3 磷酸化位点分析
• 3.4 疏水性分析
• 3.5 跨膜区预测
• 3.6 信号肽分析
• 3.7 二级结构预测
• 3.8 三级结构预测
• 3.9 BmIRP蛋白的功能位点预测
• 3.10 氨基酸序列同源性分析
• 3.11 进化树的构建
• 3.12 电子表达谱预测
• 3.13 BmIRP蛋白细胞内定位分析
• 4 讨论
• 第四章 多角体融合蛋白Polh-BmIRP的原核表达与纯化
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 重组pET-28a-Polh质粒的构建
• 2.2 原核重组表达载体pET-28a-Polh-BmIRP的构建
• 2.3 原核表达融合蛋白Polh-BmIRP
• 2.4 表达产物Polh-BmIRP融合蛋白的纯化
• 2.5 Bradford法定量
• 2.6 质谱鉴定融合蛋白Polh-BmIRP
• 2.7 扫描电镜下观察融合蛋白
• 3. 结果
• 3.1 Polh基因扩增结果
• 3.2 重组pET-28a-Polh的构建
• 3.3 BmIRP基因扩增结果
• 3.4 重组表达载体pET-28a-Polh-BmIRP的构建
• 3.5 重组表达载体pET-28a-BmIRP的构建
• 3.6 重组质粒pET-28a-Polh-BmIRP及pET-28a-BmIRP的序列测定
• 3.7 重组pET-28a-Polh-BmIRP及pET-28a-BmIRP转化E.coli BL21诱导表达
• 3.8 Western blotting鉴定融合蛋白表达
• 3.9 重组表达产物Polh-BmIRP的纯化
• 3.10 蛋白含量测定
• 3.11 MALDI-TOF-MS鉴定融合蛋白
• 3.12 扫描电镜下观察融合蛋白Polh-BmIRP结构
• 4 讨论
• 第五章 融合蛋白Polh-BmIRP的晶体培养
• 1 实验材料及设备
• 2 实验方法
• 2.1 蛋白样品的处理
• 2.2 盖玻片的预处理
• 2.3 晶体培养
• 2.4 晶体观测
• 3 结果
• 4 讨论
• 第六章 多角体融合蛋白Polh-BmIRP的真核表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 2. 方法
• 2.1 重组转移载体pFastBac HTb-Polh-BmIRP的构建
• 2.2 重组Bacmid-Polh-BmIRP质粒的构建
• 2.3 家蚕BmN细胞培养
• 2.4 脂质体转染家蚕卵巢上皮细胞BmN
• 2.5 重组Bacmid病毒的鉴定
• 2.6 病毒滴度测定
• 2.7 病毒的扩增培养
• 2.8 融合蛋白在家蚕BmN细胞中的表达和鉴定
• 3 结果
• 3.1 重组pFastBac HTb-Polh-BmIRP质粒鉴定
• 3.2 重组Bacmid质粒鉴定
• 3.3 融合蛋白Polh-BmIRP的真核表达
• 4 讨论
• 第七章 BmIRP 基因的RNAi对家蚕培养细胞生物活性及细胞周期的影响
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料与设备
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 dsRNA的合成
• 2.2 RNAi----dsRNA的转染
• 2.3 MTT检测BmIRP基因沉默后家蚕BmN细胞的生物活性
• 2.4 流式细胞仪检测
• 3 结果
• 3.1 dsRNA的合成
• 3.2 BmIRP RNAi的MTT检测结果分析
• 3.3 流式细胞仪检测
• 4 讨论
• 第八章 荧光定量PCR分析BmIRP基因在家蚕组织中的转录水平
• 1 材料与试剂
• 1.1 主要材料和仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 家蚕五龄幼虫组织的提取
• 2.2 各组织总RNA提取
• 2.3 DNA酶处理总RNA
• 2.4 cDNA第一链的合成
• 2.5 荧光定量PCR分析
• 3 结果与讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢