甜菜硝酸还原酶基因克隆及生物信息学分析

论文摘要

甜菜是我国北方特有的糖料作物,在我国北方农业生产中占有重要地位。目前黑龙江省乃至全国甜菜单产不高、总产不稳,特别是含糖率呈下降趋势,已成为限制我国甜菜糖业发展的障碍性因子。氮素供应不合理是主要原因之一。硝酸还原酶是氮素代谢的关键酶和限速酶,研究NR的功能对提高甜菜的产量具有重要作用。目前对甜菜NR的研究主要集中在NR活性的动态变化和氮素对NR活性的调节方面,而对甜菜NR结构和特性的研究确少有报道。本研究以二倍体栽培甜菜甜研7号为试验材料,运用RT-PCR并5’/3’-RACE法首次分离了甜菜的NR基因。在此基础上,利用生物信息学手段对甜菜NRcDNA推导出的蛋白质序列进行主要结构分析和功能预测,旨在从酶分子的结构上揭示甜菜硝酸还原酶的调控机理。研究结果如下:1利用RT-PCR和5’/3’-RACE成功地从甜菜叶片中首次分离了NR的全长基因（SbNR）,登录号EU163265,长度为3247bp,可编码905个氨基酸,而且核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与其它植物NR基因具有较高的同源性。同时运用PCR扩增技术首次克隆了甜菜NR基因组序列,登录号为EU571714,测序结果表明,基因组DNA长度为6346bp,含有4个外显子和3个内含子,内含子长度分别为197bp,1088bp和2343bp。2采用ANTHEPROT软件分析了SbNR的理化特性,并运用ClustalW服务器构建了SbNR的系统发育树,结果表明,甜菜SbNR为易溶、亲水性强的蛋白,理论等电点pI为6.09,相对分子量为102kDa。甜菜NR与菠菜（Spinacia oleracea）NR的亲缘关系最近。二级结构预测结果显示,NR的α螺旋在30%左右,β折叠在20%左右,表明NR为混合型蛋白。另外,应用同源建模法进行NR三维结构的预测,NR共有3个β折叠区,折叠区间由α螺旋来连接,共有16个螺旋。3通过网络服务器平台进行SbNR的功能预测,结果显示SbNR为NR的成员之一,含有钼辅因子结合域,细胞色素b5结合域,FAD结合域及NADH结合域,具有跨膜区域,但不含有信号肽,表明SbNR可能作为膜受体起作用。4使用甜菜NR的DNA特异序列作为探针检测甜菜基因组中NR基因的拷贝数。采用四种限制性内切酶（EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,DraⅠ）消化甜菜的基因组DNA,将凝胶电泳分离的酶切谱带原位转移到尼龙膜上,免疫检测呈现出1-4条不等的杂交信号,其中,EcoRⅠ酶切泳道的杂交条带最多,并处于3-5kb之间,HindⅢ和DraⅠ酶切泳道的杂交信号为一条,BamHⅠ的酶切泳道出现两条杂交信号,而且其中一条大于6kb。上述杂交结果表明,RT-PCR扩增得到的NRcDNA是甜菜基因组DNA的表达产物,而且NR基因在甜菜的基因组中可能是单拷贝或者低拷贝。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 硝酸还原酶的研究现状
• 1.2.1 硝酸还原酶的分布和类型
• 1.2.2 硝酸还原酶的结构与功能
• 1.2.3 硝酸还原酶活性的调节
• 1.2.4 植物中已克隆的硝酸还原酶基因
• 1.3 基因克隆的方法
• 1.3.1 基因克隆方法的选择原则
• 1.3.2 基因克隆的方法
• 1.4 本研究课题的来源及主要研究内容
• 1.4.1 本研究课题的来源
• 1.4.2 本研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试品种
• 2.1.2 试验所涉及的菌株和质粒
• 2.1.3 试验所涉及的酶，试剂盒及生化试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 甜菜硝酸还原酶cDNA 的克隆
• 2.2.1 NR cDNA 克隆的技术路线
• 2.2.2 试验材料甜菜的用前准备
• 2.2.3 硝酸还原酶活力的测定
• 2.2.4 甜菜叶片总RNA 的提取
• 2.2.5 反转录合成cDNA 的第一链
• 2.2.6 P1 的克隆
• 2.2.7 cDNA 5′端的克隆
• 2.2.8 P2 的克隆
• 2.2.9 cDNA 3′端的克隆
• 2.2.10 P3 的克隆
• 2.2.11 cDNA 全长的克隆
• 2.3 甜菜硝酸还原酶基因组DNA（gDNA）的克隆
• 2.3.1 试验材料甜菜的用前准备
• 2.3.2 CTAB 法提取gDNA
• 2.3.3 gDNA 的完整性分析
• 2.3.4 gDNA5′端的克隆
• 2.3.5 gDNA MS 的克隆
• 2.3.6 gDNA3′端的克隆
• 2.3.7 gDNA 全长的克隆
• 2.4 甜菜硝酸还原酶基因的Southern 杂交分析
• 2.4.1 探针的标记
• 2.4.2 SDS 法提取高纯度的甜菜基因组DNA
• 2.4.3 基因组DNA 的酶切
• 2.4.4 凝胶的变性
• 2.4.5 转膜
• 2.4.6 DNA 的固定
• 2.4.7 预杂交与杂交
• 2.4.8 洗膜
• 2.4.9 免疫检测
• 2.5 甜菜硝酸还原酶的生物信息学分析
• 2.5.1 生物信息学软件和网络服务器
• 2.5.2 甜菜NR 基因编码蛋白的结构分析
• 2.5.3 甜菜NR 基因编码蛋白的功能分析
• 3 结果与分析
• 3.1 甜菜硝酸还原酶cDNA 的克隆
• 3.1.1 不同诱导时间甜菜叶片NR 活力的测定
• 3.1.2 甜菜总RNA 的提取及检测
• 3.1.3 P1 的克隆
• 3.1.4 cDNA 5′端的克隆
• 3.1.5 P2 的克隆
• 3.1.6 cDNA 3′端的克隆
• 3.1.7 P3 的克隆
• 3.1.8 cDNA 全长的克隆
• 3.2 甜菜硝酸还原酶基因组DNA（gDNA）的克隆
• 3.2.1 甜菜gDNA 的提取及检测
• 3.2.2 gDNA 5′端的克隆
• 3.2.3 gDNA MS 的克隆
• 3.2.4 gDNA 3′端的克隆
• 3.2.5 gDNA 全长的克隆
• 3.3 甜菜硝酸还原酶基因的Southern 杂交分析
• 3.3.1 探针的标记
• 3.3.2 SDS 法提取的甜菜基因组DNA
• 3.3.3 杂交免疫检测
• 3.4 甜菜硝酸还原酶的生物信息学分析
• 3.4.1 甜菜NR 基因编码蛋白的结构分析
• 3.4.2 甜菜NR 基因编码蛋白的功能分析
• 4 讨论
• 4.1 试验选材
• 4.2 甜菜的诱导处理及RNA 提取
• 4.3 RACE 法克隆目的基因
• 4.4 Southern 杂交检测基因的拷贝数
• 4.5 甜菜NR 的生物信息学分析
• 4.6 甜菜NR 核苷酸序列的测序结果分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文