苎麻转PSAG12-IPT基因和Bt基因的分子检测及性状考察

论文摘要

苎麻是我国传统的纤维作物之一,历史上在我国的农业生产中占有重要地位。随着社会的发展,市场需求的变化,苎麻生产的发展面临诸多挑战,如人口的增加,耕地面积的逐年减少等。因此,提高苎麻单产成为保持苎麻产业可持续发展的有效途径。目前,传统育种方法的局限性已逐步显现。植物基因工程为苎麻育种带来了新的途径。将苎麻导入各种目的基因后,经过选育,有望获得苎麻新品种。PSAG12-IPT基因能自我调节细胞分裂素的产生,延缓植物叶片的衰老。Bt基因为编码苏云金杆菌毒蛋白的基因,是当今农业上利用最广的一种杀虫基因。本实验室在建立了苎麻的遗传转化体系后,将PSAG12-IPT基因和Bt基因分别导入苎麻品系“5041”和苎麻品种“芦竹青”中,并获得了大量的转基因株系。本研究对获得的转PSAG12-IPT基因和Bt基因苎麻植株进行了分子检测,从分子水平上验证了目的基因已整合在苎麻基因组中,并能够稳定遗传;对转PSAG12-IPT基因苎麻T0代株系的光合特性等进行了测定,对转Bt基因苎麻T0代株系的抗虫性进行了室内鉴定,并对两个转基因材料T0代和T1代株系的农艺性状和品质性状等进行了考察。主要研究结果如下:1.利用PCR、Southern杂交等技术对转基因苎麻T0代和T1代株系进行检测,均检测到阳性植株。在T0代转基因苎麻“5041”中,NptⅡ基因（选择标记基因）的PCR阳性率为80.1%,PSAG12-IPT基因（目的基因）的PCR阳性率为69.8%,共转化率为66.1%;在T0代转基因苎麻“芦竹青”中,NptⅡ基因（选择标记基因）的PCR阳性率为73.8%,Bt基因（目的基因）的PCR阳性率为33.4%,共转化率为33.4%。外源基因在不同材料中的遗传行为不同,对T1代转基因苎麻进行Km选择培养和PCR检测发现,在转基因苎麻“5041”中,NptⅡ基因和PSAG12-IPT基因的遗传符合3:1的比例,而在转基因苎麻“芦竹青”中,NptⅡ基因的遗传比符合1:1,Bt基因的遗传符合3:1的比例。Southern分子杂交结果进一步验证了上述结论。表明本实验室获得了转基因苎麻T0代和T1代植株,为进一步进行生理指标的测定和性状考察研究奠定了基础。2.在大田环境下,转PSAG12-IPT基因T0代苎麻的光补偿点、表观量子效率和暗呼吸速率和对照间存在显著差异;在净光合速率（Pn）的日变化中,转基因苎麻部分株系表现为单峰曲线,其他株系表现为双峰曲线,而对照始终表现为单峰曲线;对转基因苎麻株系的叶绿素含量进行了测定,在头麻和二麻纤维成熟期,叶绿素b含量均低于对照,而叶绿素a/b值均高于对照。相关分析表明,在Pn和主要生理因子的关系中,转基因苎麻头、二麻呈显著性相关,三麻的相关性不显著。另外,T0代转基因株系P513和P504的内源细胞分裂素含量显著高于对照,而且植株形态表现异常,T0代其他转基因株系及T1代各转基因株系内源细胞分裂素的含量和对照相比没有显著差异。PSAG12-IPT基因的导入导致苎麻的生理特性发生了改变。3.通过室内抗虫性生物检测,转Bt基因苎麻株系叶片对苎麻赤蛱蝶幼虫的生长具有抑制作用。转基因株系均表现出了一定的抗性,其中株系SBL2叶片喂养的苎麻赤蛱蝶幼虫死亡率达到38.7%,株系SBL3叶片喂养的苎麻赤蛱蝶蛹死亡率达到24.8%,株系SBL2叶片喂养的苎麻赤蛱蝶成虫畸形率达到40.0%。同时用转Bt基因植株和非转基因植株的叶片喂食苎麻赤蛱蝶幼虫,这些幼虫更趋向于取食非转基因叶片,转基因植株的叶片受到苎麻赤蛱蝶幼虫危害的程度要明显低于对照。在转Bt基因T1代材料中,将阳性植株种植在常年苎麻赤蛱蝶发生严重的田块,在自然发虫状态下观察,非转基因植株的叶片被害虫取食,个别单株的叶片甚至被食光,而转基因植株没有受到苎麻赤蛱蝶幼虫的危害。4.转PSAG12-IPT基因苎麻T0代株系和对照相比,植物学性状发生了一定程度的变异,如株系P504茎中上部发生很多分枝;株系P513在每季麻生育后期,整株叶片从下往上叶缘向上发生翻卷;部分株系发生了自交不育现象。转基因株系的农艺性状和品质性状也产生了显著变异:株系P502的主要性状指标优于受体品系5041;大部分株系部分性状指标优于对照,部分性状指标劣于对照;少数株系的某些性状甚至发生了特殊变异。转Bt基因苎麻和对照相比,T0代株系性状并无大的变化,转Bt基因苎麻基本保持了原品种的特性。对两个转基因材料T0代和T1代的农艺性状和品质性状进行比较发现,外源基因没有改变转基因苎麻的遗传行为。5.本研究获得了具有利用价值的转基因材料。如转PSAG12-IPT基因株系P502,不仅单株原麻重高于对照,而且株高、分株力等农艺性状和纤维支数等品质性状显著优于对照,这将是一个好的育种材料;转PSAG12-IPT基因株系P506和P512的单株原麻重极显著高于对照,转PSAG12-IPT基因株系P513的纤维支数极显著高于对照,转Bt基因株系SBL2的抗虫性显著优于对照等,这些将是很好的育种中间材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表Abbreviation
• 第一章 文献综述
• 1 苎麻生产现状
• 1.1 苎麻在农业生产上的作用
• 1.2 苎麻生产和加工概况
• 1.2.1 苎麻生产概况
• 1.2.2 苎麻加工概况
• 2 苎麻生物技术和我国苎麻育种研究进展
• 2.1 苎麻生物技术研究进展
• 2.2 我国苎麻育种研究进展
• 3 植物遗传转化方法与苎麻遗传转化研究进展
• 3.1 植物遗传转化方法
• 3.2 苎麻遗传转化研究进展
• SAG12-IPT基因的研究'>4 有关P_SAG12-IPT基因的研究
• 4.1 细胞分裂素与植物衰老的关系
• 4.1.1 细胞分裂素的作用
• 4.1.2 植物内源细胞分裂素含量变化与衰老的关系
• SAG12-IPT基因的获得及作用'>4.2 P_SAG12-IPT基因的获得及作用
• 4.3 植物叶片衰老相关基因
• 4.3.1 叶片衰老相关基因的研究
• 4.3.2 叶片衰老调控的研究
• SAG12-IPT基因研究进展'>4.4 P_SAG12-IPT基因研究进展
• SAG12-IPT基因遗传转化的研究'>4.4.1 P_SAG12-IPT基因遗传转化的研究
• SAG12-IPT基因植株生理特性及抗性的研究'>4.4.2 转 P_SAG12-IPT基因植株生理特性及抗性的研究
• SAG12-IPT基因植物的利用'>4.4.3 转P_SAG12-IPT基因植物的利用
• 5 有关Bt基因的研究
• 5.1 植物抗虫基因种类
• 5.2 Bt杀虫蛋白及其基因的分类
• 5.3 Bt杀虫晶体蛋白的杀虫原理
• 5.4 转Bt基因植物的起源
• 5.5 转Bt基因抗虫作物的应用及现状
• 5.6 苎麻转Bt基因研究进展
• 6 本研究的目的意义
• 0代和T₁代植株的分子检测及遗传分析'>第二章 两个转基因苎麻T₀代和T₁代植株的分子检测及遗传分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 苎麻基因组DNA小量提取（用于PCR）
• 2.2.2 苎麻基因组DNA大量提取（用于Southern杂交）
• 2.2.3 PCR检测
• 2.2.4 southern分子杂交检测
• 1代种子消毒'>2.2.5 T₁代种子消毒
• 2.3 遗传分析方法
• 3 结果与分析
• SAG12-IPT基因和转Bt基因T₀代植株的分子检测'>3.1 转P_SAG12-IPT基因和转Bt基因T₀代植株的分子检测
• SAG12-IPT基因T₀代植株的分子检测'>3.1.1 转P_SAG12-IPT基因T₀代植株的分子检测
• 0代植株的分子检测'>3.1.2 转Bt基因T₀代植株的分子检测
• SAG12-IPT基因和转Bt基因T₁代植株的分子检测及遗传分析'>3.2 转P_SAG12-IPT基因和转Bt基因T₁代植株的分子检测及遗传分析
• SAG12-IPT基因T₁代植株的分子检测及遗传分析'>3.2.1 转P_SAG12-IPT基因T₁代植株的分子检测及遗传分析
• 1代植株的分子检测及遗传分析'>3.2.2 转Bt基因T₁代植株的分子检测及遗传分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 PCR检测方法的选择
• 4.2 苎麻基因转化率和共转化率的探讨
• 4.3 转基因苎麻苗的选择培养
• 4.4 转基因苎麻外源基因的遗传行为
• SAG12-IPT基因苎麻"5041"生理指标的测定及性状考察'>第三章 转P_SAG12-IPT基因苎麻"5041"生理指标的测定及性状考察
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 0代转基因苎麻和对照光合特性的测定'>2.2.1 T₀代转基因苎麻和对照光合特性的测定
• 0代和T₁代转基因苎麻和对照细胞分裂素含量的测定'>2.2.2 T₀代和T₁代转基因苎麻和对照细胞分裂素含量的测定
• 0代转基因苎麻和对照植物学性状的考察'>2.2.3 T₀代转基因苎麻和对照植物学性状的考察
• 0代和T₁代转基因苎麻和对照农艺性状及品质性状的考察'>2.2.4 T₀代和T₁代转基因苎麻和对照农艺性状及品质性状的考察
• 3 结果与分析
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻的光合特性'>3.1 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻的光合特性
• SAG12-IPT基因苎麻株系的光合-光响应'>3.1.1 转P_SAG12-IPT基因苎麻株系的光合-光响应
• SAG12-IPT基因苎麻株系Pn的日变化'>3.1.2 转P_SAG12-IPT基因苎麻株系Pn的日变化
• SAG12-IPT基因苎麻株系生育中后期Pn的变化趋势'>3.1.3 转P_SAG12-IPT基因苎麻株系生育中后期Pn的变化趋势
• SAG12-IPT基因苎麻和CK5041的光合生理特性'>3.1.4 转P_SAG12-IPT基因苎麻和CK5041的光合生理特性
• 3.1.5 不同株系与对照叶绿素含量的比较
• 0代和T₁代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照细胞分裂素含量'>3.2 T₀代和T₁代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照细胞分裂素含量
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻植株内源细胞分裂素含量分析'>3.2.1 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻植株内源细胞分裂素含量分析
• 1代转P_SAG12-IPT基因植株内源细胞分裂素含量分析'>3.2.2 T₁代转P_SAG12-IPT基因植株内源细胞分裂素含量分析
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻株系植物学性状'>3.3 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻株系植物学性状
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照的农艺性状及品质性状'>3.4 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照的农艺性状及品质性状
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照的农艺性状'>3.4.1 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照的农艺性状
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照的品质性状'>3.4.2 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照的品质性状
• 0代和T₁代转基因苎麻和对照农艺性状及品质性状的比较'>3.5 T₀代和T₁代转基因苎麻和对照农艺性状及品质性状的比较
• 0代和T₁代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照农艺性状的比较'>3.5.1 T₀代和T₁代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照农艺性状的比较
• 0代和T₁代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照品质性状的比较'>3.5.2 T₀代和T₁代转P_SAG12-IPT基因苎麻和对照品质性状的比较
• 4 小结与讨论
• SAG12-IPT基因苎麻光合特性的变化'>4.1 转P_SAG12-IPT基因苎麻光合特性的变化
• 0代和T₁代转P（SAG12）-IPT基因苎麻内源细胞分裂素的含量'>4.2 T₀代和T₁代转P（SAG12）-IPT基因苎麻内源细胞分裂素的含量
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻性状的分析'>4.3 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻性状的分析
• 0代转P_SAG12-IPT基因苎麻农艺性状和品质性状的遗传'>4.4 T₀代转P_SAG12-IPT基因苎麻农艺性状和品质性状的遗传
• SAG12-IPT基因苎麻T₀代和T₁代材料取样的说明'>4.5 转P_SAG12-IPT基因苎麻T₀代和T₁代材料取样的说明
• SAG12-IPT基因苎麻利用的探讨'>4.6 转P_SAG12-IPT基因苎麻利用的探讨
• 第四章 转Bt基因苎麻"芦竹青"抗虫性鉴定及性状考察
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试的植物材料
• 2.1.2 供试的昆虫材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 苎麻赤蛱蝶室内抗性测定
• 0代和T₁代主要农艺性状、品质性状考察'>2.2.2 转Bt基因苎麻T₀代和T₁代主要农艺性状、品质性状考察
• 3 结果与分析
• 3.1 苎麻赤蛱蝶幼虫室内喂养体重测定
• 3.2 苎麻赤蛱蝶幼虫死亡率、蛹死亡率和成虫畸形率的测定
• 3.3 苎麻赤蛱蝶幼虫取食的选择性
• 1代植株的田间抗性评价'>3.4 转Bt基因T₁代植株的田间抗性评价
• 0代苎麻主要农艺性状和品质性状'>3.5 转Bt基因T₀代苎麻主要农艺性状和品质性状
• 0代和T₁代主要农艺性状和品质性状的比较'>3.6 转Bt基因苎麻T₀代和T₁代主要农艺性状和品质性状的比较
• 0代和T₁代主要农艺性状'>3.6.1 转Bt基因苎麻T₀代和T₁代主要农艺性状
• 0代和T₁代主要品质性状'>3.6.2 转Bt基因苎麻T₀代和T₁代主要品质性状
• 4 小结与讨论
• 4.1 转Bt基因苎麻室内抗性的评价
• 4.2 转Bt基因苎麻抗虫效果探讨
• 4.3 转Bt基因苎麻的抗虫效应
• 第五章 结论与展望
• 5.1 转基因苎麻的分子检测
• SAG12-IPT基因苎麻材料"CK5041"的评价'>5.2 转P_SAG12-IPT基因苎麻材料"CK5041"的评价
• 5.3 转Bt基因苎麻"芦竹青"的抗性评价
• 参考文献
• 附录
• 致谢