生物催化法制备普瑞巴林关键手性中间体及其年产10吨规模的工厂工艺设计

论文摘要

普瑞巴林是治疗神经性疼痛和癫痫的药物,（3S）-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的重要手性中间体。生物催化法合成普瑞巴林已成为目前研究和开发的热点,该工艺路线符合绿色化学及可持续发展的要求,具有重要的工业应用价值。本论文对本实验室构建的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET28b-TLL进行了产酶条件的优化,然后利用重组脂肪酶实现了外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯到（3S）-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的转化,建立了一条适于工业化生产的工艺路线,最后进行了年产10吨普瑞巴林关键手性中间体的物料衡算,为普瑞巴林中间体的工业化生产提供了理论基础。以E.coli BL21（DE3）/pET28b-TLL为出发菌株,通过单因素法实验,确定了菌株在5 L发酵罐分批发酵工艺,温度:诱导前37 ℃,诱导后28℃,搅拌转速500r/min,通气量1.5L/min,种龄8h,接种量2%,OD600=7左右加入10g/L乳糖进行诱导,最终得到平均菌体量为8.28 g/LDCW,酶活为252.36 U/L,为分批补料发酵奠定了基础。优化得到5L罐分批补料发酵的工艺。温度:诱导前37℃,12 h后降温至28℃诱导表达14 h。pH值:pH始终控制在7.2,20%氨水自动调节。溶解氧:空气流量设定为1.5 L/min。在整个发酵过程中溶氧控制在50%。搅拌速度:补料开始后,采用溶氧联动搅拌的控制模式。补料策略:补料由溶氧反馈控制,当溶氧高于50%时补加培养基,补料速率为10 mL/min,补料周期为1S/20S。诱导方式:发酵12 h后,降温到28℃,加入乳糖45 g,18 h时再次加入45 g乳糖,使其终浓度为30 g/L。最终得到菌体干重为38.42 g/L,酶活为798.45 U/L。在200 mL转化体系中优化静息细胞催化合成普瑞巴林关键手性中间体的工艺条件,并成功放大到2 L反应体系。工艺参数为:温度:50℃,pH8.0,乙酸钙浓度150mM,菌体浓度75g/L,底物分4次加入,每次600 mM,反应24 h,最终底物的转化率为28.93%,e.e.值 92.59%,时空产率为 8.18g/（L·h）。进行了发酵工段,生物催化工段和脱羧工段生产工艺流程设计,进行了物料衡算,为实现年产10吨普瑞巴林关健手性中间体的生产目标提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 普瑞巴林
• 1.2.1 普瑞巴林简介
• 1.2.2 普瑞巴林的合成途径
• 1.3 脂肪酶
• 1.3.1 脂肪酶的来源
• 1.3.2 脂肪酶的结构和性质
• 1.3.3 脂肪酶的分类
• 1.3.4 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在手性化合物制备中的应用
• 1.4 外源基因在大肠杆菌中的表达
• 1.4.1 表达载体的影响
• 1.4.2 目的基因序列对表达的影响
• 1.4.3 表达策略的影响
• 1.4.4 培养条件的影响
• 1.4.5 重组大肠杆菌的高密度发酵技术
• 1.5 本论文的选题意义及研究内容
• 1.5.1 本论文的选题意义
• 1.5.2 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 5L发酵罐分批发酵工艺优化
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种与培养基
• 2.2.2 仪器设备（见附录Ⅰ）
• 2.2.3 发酵工艺
• 2.2.4 分批发酵结果分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 600值与干重的关系'>2.3.1 菌体OD₆₀₀值与干重的关系
• 2.3.2 种子对工程菌生长及其产脂肪酶的影响
• 2.3.3 诱导剂对工程菌生长及其产脂肪酶的影响
• 2.3.4 溶氧对工程菌生长及其产脂肪酶的影响
• 2.3.5 重复试验
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 5L发酵罐分批补料发酵工艺的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 OD标准曲线（见第二章）
• 3.3.2 葡萄糖标准曲线
• 3.3.3 不同补料培养基对Ecoli BL21/pET28b-TLL生长和脂肪酶表达的影响
• 3.3.4 补料控制工艺的选择
• 3.3.5 诱导时机对工程菌生长和脂肪酶表达的影响
• 3.3.6 诱导剂浓度对工程菌生长和脂肪酶表达的影响
• 3.3.7 乳糖加入方式对工程菌生长和脂肪酶表达的影响
• 3.3.8 验证实验
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 重组脂肪酶催化转化普瑞巴林关键手性中间体工艺条件的优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种与培养基
• 4.2.2 静息细胞的制备
• 4.2.3 静息细胞的转化
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 温度对细胞转化的影响
• 4.3.2 pH对静息细胞转化的影响
• 4.3.3 金属盐离子对静息细胞转化的影响
• 4.3.4 乙酸钙浓度对细胞转化的影响
• 4.3.5 底物浓度对细胞转化的影响
• 4.3.6 不同投料方式对转化的影响
• 4.3.7 不同细胞浓度对转化的影响
• 4.3.8 补料方式的优化
• 4.3.9 放大到2L反应体系实验
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 生产工艺设计和物料衡算
• 5.1 普瑞巴林关键手性中间体生产工艺设计
• 5.1.1 普瑞巴林关键手性中间体生产工艺流程图
• 5.1.2 带控制点的生产工艺流程图（见附录Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ ）
• 5.1.3 普瑞巴林关键手性中间体的生产工艺
• 5.2 物料衡算
• 5.2.1 生产能力、设备数量和容积的确定
• 5.2.2 发酵工段物料衡算
• 5.3 本章小结
• 参考文献
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 附录