马铃薯块茎蛋白质双向电泳技术体系建立及发育相关蛋白质的分析

论文摘要

蛋白质组学研究在功能基因组时代发挥着越来越重要的作用。双向电泳（2-DE）技术是其关键技术之一,具有重复性好、极敏感和分辨率高等特点。马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界上第四大粮食作物,对其块茎的发生发育过程进行研究,了解其块茎发育的机理,将为马铃薯的栽培、育种和生产提供理论依据。马铃薯块茎的发育是一个复杂而又有规律的过程,块茎蛋白质的数量、种类、丰度等在不同发育阶段存在着一定的差异,而这些差异蛋白质又参与基因的表达和块茎某些重要性状的调控。因此,对马铃薯块茎蛋白质组进行研究有助于我们对块茎生长和发育机理的理解,也对马铃薯块茎产量及品质等性状的提高具有一定的现实意义。深入研究块茎蛋白质在发育过程中的差异表达,首先需要建立起马铃薯块茎蛋白质的2-DE体系,而样品的制备则是2-DE的关键环节,直接影响2-DE的分辨率和重复性。实验中,我们采用三氯乙酸/丙酮沉淀法,改良三氯乙酸/丙酮沉淀法,酚提取法和两步沉淀四种方法提取马铃薯块茎蛋白质,进行2-DE分离,对四种方法提取样品蛋白质的获得量、纯度及2-DE蛋白质图谱分辨率进行了比较。结果表明:两步沉淀法提取块茎蛋白质的获得量和纯度较其它三种提取方法高,2-DE蛋白质图谱较清晰、分辨率高。两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质及其2-DE电泳技术的建立,为研究马铃薯块茎蛋白质组学提供了技术支撑。用两步沉淀法提取马铃薯块茎发育过程中四个阶段的蛋白质,即匍匐茎的诱导和发生,匍匐茎的伸长,匍匐茎纵向生长的停止和块茎的发生及膨大阶段,并进行双向电泳分析。结果表明:马铃薯块茎蛋白质主要集中在分子量在15.5 kD-87.2 kD范围,等电点范围在3.8-7.2区域内。（107.8 kD,pI 4.9）、（37.7 kD,pI 7.3）、（42.8 kD,pI 6.2）、（21.3 kD,pI 8.9）、（37.7 kD,pI 6.0）、（33.8 kD,pI 7.2）、（23.7 kD,pI 5.1）和（77.3 kD,pI 6.4）八个蛋白质点只在第一发育阶段特异表达,在随后的发育过程中不再出现;在匍匐茎的伸长阶段,新出现了十三个蛋白质点,其中（25.2 kD,pI 8.6）、（26.3 kD,pI 7.7）和（30.4 kD,pI 6.1）三个点在随后的发育过程又消失,另外三个蛋白质点（51.3 kD,pI 5.8）、（51.6 kD,pI 6.7）和（50.9 kD,pI 4.2）的丰度在该阶段明显下调;在匍匐茎纵向生长的停止阶段,出现十个新蛋白质点,其中五个蛋白质点（45.1 kD,pI 6.8）、（45.3 kD,pI 4.8）、（44.3 kD,pI 6.1）、（44.7 kD,pI 5.2）和（42.9 kD,pI 7.3）只在该阶段特异表达,在丰度明显上调的十四个蛋白质点中,（22.7 kD,pI 8.8）在该发育阶段的丰度表现为最高,在块茎的发生及膨大阶段该蛋白质点的丰度又下调,另有十七个蛋白质点的丰度明显下调,其中变化最明显的为（61.3 kD,pI 6.8）和（58.5 kD,pI 6.4）两个点;在第四发育阶段即块茎开始膨大时有二十二个新蛋白质点出现,且都分布在较低分子量（53 kD-23 kD）范围内,丰度明显上调和下调的蛋白质点分别有十九和九个;Patatin蛋白在整个发育过程中其丰度明显增加。在块茎的整个发育过程中,这些蛋白质可能是这些发育阶段特异表达的蛋白质,它们的出现和消失可能与相应的发育阶段密切相关。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛋白质组学产生的背景和相关概念
• 1.2 国内外蛋白质组学研究的现状
• 1.3 蛋白质组学研究的技术路线及相关技术
• 1.3.1 基于凝胶的蛋白质组学
• 1.3.2 基于质谱的蛋白质组学
• 1.3.3 基于芯片的蛋白质组学
• 1.3.4 基于酵母双杂交的蛋白质组学
• 1.4 马铃薯蛋白质组学的研究进展
• 1.4.1 马铃薯块茎的生长发育机理
• 1.4.2 马铃薯亚细胞水平的蛋白质组研究
• 1.4.3 马铃薯组织和器官中的蛋白质组研究
• 1.4.4 植物发育相关蛋白质研究
• 1.5 本研究的目的及意义
• 第二章 马铃薯块茎蛋白质双向电泳技术体系的建立
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 试剂和仪器
• 2.2.3 电泳储液及溶液配方
• 2.2.4 蛋白质粗提物的制备
• 2.2.5 蛋白质提取
• 2.2.6 蛋白质定量
• 2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D SDS-PAGE）
• 2.2.8 双向电泳（2-DE）
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 蛋白质获得量及纯度的比较
• 2.3.2 电泳结果的比较
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 马铃薯块茎发育过程中蛋白质的双向电泳分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 图象的扫描和分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 1D SDS-PAGE 结果与分析
• 3.3.2 2-DE 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介