论文摘要
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,约占成人颅内肿瘤的35%～60%,其中恶性胶质瘤约占60%,预后差,病死率高。在胶质瘤的发生、发展中有多种基因的连锁改变,这些改变最终使肿瘤细胞获得无限增殖的生长优势,从而促进肿瘤的发生和发展。垂体瘤转化基因PTTG,又称Securin,是一种致癌基因,是1997年Pei等人在老鼠脑垂体肿瘤GH4细胞系的研究中被发现的。PTTG1在许多肿瘤中高表达。其在肿瘤发生中作用机制涉及到细胞转化、非整数倍细胞分裂、细胞调亡和影响致瘤的微环境。目前国外仅有小宗脑胶质瘤标本的研究,尚无PTTG1基因表达与脑胶质瘤病理类型、增殖活性、生物学行为等方面的研究报道。为探讨PTTG1基因在胶质瘤发生发展中的作用,本课题通过对胶质瘤中PTTG1表达与胶质瘤恶性程度、肿瘤细胞增殖活性及其相互关系进行了研究,并通过体内、体外试验探讨PTTG1基因作为基因治疗胶质瘤优选靶的之一的可行性;初步探讨PTTG1基因影响脑胶质瘤生物学特性的可能机制。1、人脑胶质瘤中PTTG1的表达和临床病理相关性分析采用实时荧光定量RT-PCR方法和Western blot杂交检测PTTG1 mRNA和蛋白在正常脑组织、胶质瘤和恶性人脑胶质瘤细胞系的表达。结果表明:在正常脑组织中未检测到PTTG1 mRNA和蛋白的表达;在各级胶质瘤中均有PTTG1的表达,其表达强度与肿瘤恶性程度呈正相关关系;在Ⅲ-Ⅳ级（高恶度）胶质瘤中高表达,而在Ⅱ级（低恶度）胶质瘤中表达量较低,Ⅲ-Ⅳ级与Ⅱ级PTTG1 mRNA、蛋白的表达量相比较有显著差异（P＜0.001）。采用免疫组化ABC法检测了4例正常脑组织及52例人脑胶质瘤石蜡标本中PTTG1蛋白的表达情况。结果显示,正常脑胶质细胞中基本无PTTG1蛋白的表达,绝大部分星形细胞瘤标本中可见PTTG1蛋白的阳性表达,其表达情况为:Ⅱ级55%（11/20）,Ⅲ级76.2%（11/15）,Ⅳ级100%（17/17）。在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级3个不同病理级别的星形细胞肿瘤中,PTTG1蛋白的阳性表达率有显著差别（P＜0.01）。大部分其它类型的胶质瘤中也可见PTTG1蛋白的阳性表达,其表达情况为:少突胶质细胞瘤75%（3/4）,室管膜瘤100%（4/4）。脑胶质瘤的临床病理级别、分化程度与PTTG1的表达阳性率之间比较有统计学上的显著差异性（P＜0.01）;而性别和年龄则无统计学上的差异（P＞0.05）。用Ki-67标记指数（Ki-67 LabelingIndex）评价胶质瘤的增殖活性,基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）对于肿瘤的侵袭具有极其重要的作用。本实验以免疫组化法检测了Ki-67、MMP2和MMP9的表达强度,Ki67 LI检验三种病理级别胶质瘤Ki67表达情况,其表达情况为:Ⅱ级（1.88）,Ⅲ级（8.94）,Ⅳ级（13.77）,统计学上有差异（P＜0.001）,说明Ki67 LI在不同级别的胶质瘤中具有显著性差异。39例胶质瘤中MMP2、MMP9蛋白阳性表达率分别是:Ⅱ级的纤维型星形细胞瘤阳性表达45%、40%,Ⅲ级的间变型星形细胞瘤80%、86.7%,Ⅳ级的多形性胶质母细胞瘤均为100%,统计学上有差异（P＜0.01）。胶质瘤中Ki-67LI、MMP2、MMP9的表达与PTTG1基因表达、肿瘤分级呈正相关,结果提示胶质瘤中PTTG1基因表达与肿瘤细胞增殖活性、侵袭性密切相关。2、microRNA靶向性抑制PTTG1表达对人脑胶质瘤细胞体外增殖、凋亡以及侵袭性的影响利用两个恶性胶质瘤体外细胞系U251和SHG-44为模型,将含靶向PTTG1的microRNA（miRNA）的质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR通过Lipofectamine介导分别转染U251人脑胶质母细胞瘤细胞和SHG-44恶性星形细胞瘤细胞,通过荧光定量PCR、Western blot、激光共聚焦显微镜、MTT法、流式细胞术（FCM）以及Caspase-3检测定性和定量研究了miRNA-PTTG1抑制PTTG1的表达,以及了解对U251、SHG-44体外细胞增殖、凋亡以及侵袭性的影响。MTT法检测细胞增殖率,发现转染后的U251、SHG-44细胞克隆生长速度明显下降。采用FCM定量分析各组细胞的调亡水平,结果显示,与未转染的U251细胞（早期调亡细胞16.9%）和转染阴性质粒的U251细胞（早期调亡细胞14.9%）相比,转染MIR-2干扰质粒U251细胞中调亡细胞明显增多,48小时后调亡细胞达20.4%,统计学上有差异（P＜0.001）;在SHG-44细胞实验中,与未转染的SHG-44细胞（早期调亡细胞15.2%）和转染阴性质粒的SHG-44细胞（早期调亡细胞14%）相比,转染MIR-2干扰质粒SHG-44细胞中调亡细胞明显增多,48小时后调亡细胞达22.2%,统计学上有差异（P＜0.001）。Caspase-3荧光活性检测也显示,转染miRNA-PTTG1的U251细胞和SHG-44细胞中Caspase-3的活性明显增加,与未转染的U251细胞（12.60%）和转染阴性质粒的U251细胞（28.04%）相比,转染MIR-2干扰质粒U251细胞中caspase-3的相对活性明显升高（56.37%）,统计学上有差异（P＜0.001）;与未转染的SHG-44细胞（27.13%）和转染阴性质粒的SHG-44细胞（29.25%）相比,转染MIR-2干扰质粒SHG-44细胞中caspase-3的相对活性明显升高（48.88%）,统计学上有差异（P＜0.001）。Matrigel体外侵袭实验和细胞迁移运动实验中,转染miRNA-PTTG1的U251细胞与U251对照组和阴性载体干扰组比较侵袭能力分别下降了36.5%和30%,迁移能力下降了64.2%和64.7%。Western blot分析:miRNA干扰PTTG1在脑胶质瘤细胞中表达后,与细胞增殖相关的蛋白Ki-67、c-myc表达下调;细胞调亡相关的蛋白p53、Bax、p21WAF1/Cip1表达上调;与肿瘤细胞侵袭性相关的蛋白MMP2、MMP9表达下降（P＜0.05）。研究结果提示:Lipofectamine-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-PTTG1复合物可成功地将针对PTTG1的外源性miRNA导入至胶质瘤内,抑制肿瘤细胞的PTTG1基因表达,对PTTG1 mRNA及蛋白明显高表达的U251、SHG-44细胞的生长和增殖有明显的抑制作用,诱导胶质瘤细胞调亡和降低恶性胶质瘤细胞的侵袭性。结果提示PTTG1基因有可能成为基因治疗恶性胶质瘤的优选靶之一。3、microRNA抑制PTTG1蛋白对人脑胶质瘤细胞裸鼠成瘤性的影响在裸鼠成瘤试验中,我们将U251细胞（A组）,U251+pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-negative（转染阴性质粒U251细胞）细胞（B组）和U251+pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-PTTG1（转染干扰质粒U251细胞）细胞（C组）分别接种于裸鼠背部皮下,每组5只裸鼠,建立人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型。定期观察肿瘤生长情况,测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,观察4周后处死动物,称瘤重。接种4周后,肉眼就可以看到,接种正常U251细胞的肿瘤明显大于其他两组。接种正常U251细胞的肿瘤明显大于其他两组。4周时测得的各组肿瘤体积分别为:Mock-U251组为（2.36±0.22）cm3;Negative-U251组为（2.06±0.08）cm3;Mir-2-U251组为（1.50±0.05）cm3。处死后,切下3组肿瘤分别称重,Mock-U251组平均瘤重为（1.71±0.13）g,Negative-U251组为（1.43±0.19）g;Mir-2-U251组为（0.74±0.07）g,结果显示,与A组和B组裸鼠相比,C组裸鼠肿瘤形成时间延迟,肿瘤生长缓慢,肿瘤体积及瘤重均明显减小（P均＜0.05）。HE染色显示各组肿瘤组织符合多形性胶质母细胞瘤的形态,靶向抑制PTTG1的miRNA干扰治疗后出现了肿瘤中心坏死,坏死区细胞稀疏,向外细胞渐增多,其间含有很多的破碎细胞,再向外则为密集的瘤细胞,并有细胞内、外的水肿和出血,同时也有不同程度的核固缩细胞。Westernblot检测显示,与A组和B组相比,C组裸鼠肿瘤组织中活性的Capase-3蛋白明显上调（P＜0.001）。上述结果提示在裸鼠肿瘤细胞中miRNA可通过抑制PTTG1蛋白的表达来拮抗PTTG1蛋白抑制细胞凋亡的作用,并激活活性Capase-3蛋白表达,从而促进了肿瘤细胞的凋亡。综上所述,本课题的结论是在胶质瘤组织中,PTTG1的蛋白表达水平随胶质瘤恶性程度的增加相应增高,PTTG1在恶性胶质瘤细胞系中高表达。PTTG1表达的升高与肿瘤分化和转移密切相关。人脑胶质瘤中PTTG1、MMP2、MMP9、Ki67的表达水平与胶质瘤的病理分级成正相关,提示在恶性胶质瘤中PTTG1与胶质瘤的恶性表型（增殖和侵袭）密切相关。microRNA干扰PTTG1表达后,western blot检测的细胞增殖密切相关的核抗原Ki67以及MAPK级联反应中的靶标c-myc的表达下调,MTT实验的结果提示抑制PTTG1表达后U251、SHG-44人脑胶质瘤细胞系的细胞增殖率均明显下降,都出现了生长减慢。利用基因沉默技术靶向PTTG1的microRNA表达载体有效地抑制了胶质瘤细胞系U251和SHG-44中PTTG1的表达,p53以及其下游调控基因p21WAF1/Cip1、Bax的表达都发生上调的变化,caspase-3的相对活性明显升高,从而导致P53功能上调引起Bax、P21表达上调从而激活caspase-3最终诱导胶质瘤细胞发生凋亡。PTTG1的RNA干扰可以明显逆转U251人脑胶质瘤细胞系的侵袭和迁移,MMP2、MMP9 Western杂交结果显示表达显著减少,提示PTTG1→bFGF→MMP→肿瘤细胞基底膜屏障突破这一调节通路可能是恶性脑胶质瘤侵袭性产生的重要机制之一。转染外源性microRNA抑制PTTG1基因的U251细胞在无免疫裸鼠皮下成瘤后,细胞生长减慢,胶质瘤组织细胞出现增殖抑制、凋亡增加。体内外实验证明:证实了PTTG1蛋白可能是人脑胶质瘤形成和发展过程中的一个关键蛋白,其作用机制可能是PTTG1蛋白通过促进细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡促进脑胶质瘤细胞的发生和发展,而且PTTG1和肿瘤细胞侵袭性密切相关。以PTTG1蛋白为靶点来设计新的脑胶质瘤基因治疗方法是很有前景的。
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