吡咯喹啉醌对甲基汞引起PC12细胞毒性的保护作用及其机理研究

论文摘要

汞是一种全球范围的环境污染物。甲基汞是汞的有机形式,极易透过血脑屏障和胎盘屏障,从而对成年和发育中的大脑造成中枢神经系统损伤。一般人群对于甲基汞的暴露主要是通过饮食途径,尤其是食用了被甲基汞污染的鱼类引起临床或亚临床中毒症状。虽然对于甲基汞神经毒性作用的具体机制尚不完全清楚,但诱导各种细胞发生凋亡性死亡和造成广泛的氧化损伤被认为是其毒性作用的重要原因。另外,各种抗氧化性物质能够保护神经元免受甲基汞的毒性也侧面证实了上述推断。吡咯喹啉醌（PQQ）是由某些革兰氏阴性菌产生的小分子氧醌型化合物,以非共价键形式与细菌中某些脱氢酶的活性中心连接。目前,PQQ被认为是继烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）,和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）或黄素单核苷酸（FMN）之后,在自然界中发现的一个新有机辅基。PQQ以痕量水平广泛存在于各种微生物、植物和动物组织中。由于动物和人体不能自行合成PQQ,因此其体内的PQQ主要是来源于饮食。虽然对于PQQ生物学功效的探索尚处于发展阶段,但其在营养学和药理学上的作用,尤其是神经营养和保护方面的表现,已经引起了各国科学家的注意。本研究采用PC12细胞为体外神经元模型,通过MTT、LDH试验检测了甲基汞和PQQ的细胞毒性及其相互作用关系。结果显示,甲基汞能够降低细胞存活率,破坏细胞膜完整性,且存在剂量-效应关系和时间-效应关系。甲基汞暴露前预加纳摩尔浓度的PQQ能够明显提高细胞存活率,保护细胞膜完整性。但随着PQQ处理方式不同和处理浓度的增加,其表现则有所差异。采用Hoechst33258荧光染色、PI单染检测细胞周期分布、AV/PI双染和TUNEL检测细胞凋亡等方法,表明甲基汞以浓度依赖性方式诱导PC12细胞凋亡,干扰DNA正常合成,造成细胞周期阻滞于S期。明确了甲基汞通过破坏线粒体膜电位,降低Bcl-2/Bax蛋白比率,增加ROS含量,并激活caspase级联反应,最终导致细胞经由线粒体途径凋亡。PQQ能够保护细胞免受甲基汞诱导的凋亡,缓解细胞周期阻滞现象,其作用机制是通过保持线粒体膜电位,增加Bcl-2蛋白水平,进而抑制了caspase级联反应。另外,抑制ROS过量生成可能是其发挥保护作用的重要原因。对胞内氧自由基含量、脂质过氧化程度、抗氧化酶活力和GSH水平检测发现,甲基汞暴露导致PC12细胞内O2·-、·OH和H2O2含量均显著提高,MDA水平升高也反映出细胞脂质过氧化程度增加,而抗氧化酶如SOD、CAT和GSH-Px活力明显降低,胞内GSH水平急剧减少。PQQ能够降低O2·-、·OH和H2O2等氧自由基的含量,降低MDA水平,显著提高SOD、CAT和GSH-Px活力,并能够维持胞内GSH水平。说明PQQ不仅能够直接清除氧自由基,抑制脂质过氧化损伤,同时也可以通过提高胞内抗氧化酶活力、维持硫醇水平等方式间接发挥保护作用。总之,本研究首次报道了PQQ能够缓解甲基汞对PC12细胞引起的神经毒性作用,初步阐明了其拮抗机制与抑制细胞凋亡,减少氧化损伤有关。这对于更好地了解甲基汞的毒性作用机理,为甲基汞神经毒害的防治提供了理论依据,同时也为广泛而深入地探索PQQ的生物学功能开辟了新的方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1.文献综述
• 1.1 环境汞污染及其危害
• 1.1.1 环境中汞的来源及其危害
• 1.1.2 汞的存在形式及相互转化
• 1.1.3 汞的吸收、分布及排泄过程
• 1.1.4 甲基汞的神经毒性作用及其机制
• 1.2 吡咯喹啉醌（PQQ）的研究现状
• 1.2.1 PQQ的发现简史
• 1.2.2 PQQ的自然分布
• 1.2.3 PQQ的生物合成
• 1.2.4 PQQ的生物学功能
• 1.3 本论文研究的目的、意义
• 参考文献
• 2.甲基汞诱导PC12细胞凋亡的研究
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 实验设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 MTT法测定细胞存活率
• 2.2.3 乳酸脱氢酶释放的检测
• 2.2.4 Hoechst33258荧光染色观察细胞形态变化
• 2.2.5 PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布
• 2.2.6 Annexin V-FITC和PI双染色分析细胞凋亡
• 2.2.7 TUNEL检测细胞凋亡
• 2.2.8 线粒体膜电位的测定
• 2.2.9 Bcl-2和Bax蛋白表达水平分析
• 2.2.10 Caspase-3的活性测定
• 2.2.11 ROS含量检测
• 2.2.12 统计学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 MeHg处理对细胞存活率的影响
• 2.3.2 MeHg处理对LDH释放的影响
• 2.3.3 MeHg对细胞周期的影响
• 2.3.4 MeHg对细胞凋亡的影响
• 2.3.5 MeHg对线粒体膜电位的影响
• 2.3.6 MeHg对Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响
• 2.3.7 MeHg对Caspase-3活性的影响
• 2.3.8 MeHg对ROS含量的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 参考文献
• 3.甲基汞导致PC12细胞氧化损伤的研究
• 3.1 材料与设备
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 谷胱苷肽（GSH）含量测定
• 2·^-）含量测定'>3.2.3 超氧阴离子（O₂·^-）含量测定
• 2O₂）含量测定'>3.2.4 过氧化氢（H₂O₂）含量测定
• 3.2.5 羟自由基（·OH）含量测定
• 3.2.6 丙二醛（MDA）含量测定
• 3.2.7 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 3.2.8 过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 3.2.9 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定
• 3.2.10 蛋白含量测定
• 3.2.11 统计学分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 MeHg对GSH含量的影响
• 2·^-含量的影响'>3.3.2 MeHg对O₂·^-含量的影响
• 2O₂含量的影响'>3.3.3 MeHg对H₂O₂含量的影响
• 3.3.4 MeHg对·OH含量的影响
• 3.3.5 MeHg对MDA含量的影响
• 3.3.6 MeHg对SOD活性的影响
• 3.3.7 MeHg对CAT活性的影响
• 3.3.8 MeHg对GSH-Px活性的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 4.吡咯喹啉醌对甲基汞诱导PC12细胞凋亡的保护
• 4.1 材料与设备
• 4.1.1 实验试剂
• 4.1.2 实验设备
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 MTT法测定细胞存活率
• 4.2.3 LDH释放的检测
• 4.2.4 Hoechst33258荧光染色观察细胞形态变化
• 4.2.5 PI染色流式细胞仪检测细胞周期分布
• 4.2.6 Annexin V-FITC和PI双染色分析细胞凋亡
• 4.2.7 TUNEL检测细胞凋亡
• 4.2.8 线粒体膜电位的测定
• 4.2.9 Caspase-3的活性测定
• 4.2.10 Bcl-2和Bax蛋白表达量分析
• 4.2.11 ROS含量检测
• 4.2.12 统计学分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 PQQ处理对细胞存活率的影响
• 4.3.2 PQQ与MeHg共处理对细胞存活率的影响
• 4.3.3 PQQ对LDH释放的影响
• 4.3.4 PQQ与MeHg共处理对LDH释放的影响
• 4.3.5 PQQ对MeHg导致细胞周期阻滞的影响
• 4.3.6 PQQ对MeHg导致细胞凋亡的影响
• 4.3.7 PQQ对MeHg导致线粒体膜电位降低的影响
• 4.3.8 PQQ对MeHg导致Bcl-2/Bax比率降低的影响
• 4.3.9 PQQ对MeHg导致caspase-3激活的影响
• 4.3.10 PQQ对MeHg导致ROS含量增加的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 5.吡咯喹啉醌对甲基汞导致PC12细胞氧化损伤的研究
• 5.1 材料与设备
• 5.1.1 实验试剂
• 5.1.2 实验设备
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 细胞培养
• 5.2.2 谷胱苷肽（GSH）含量测定
• 2·^-）含量测定'>5.2.3 超氧阴离子（O₂·^-）含量测定
• 2O₂）含量测定'>5.2.4 过氧化氢（H₂O₂）含量测定
• 5.2.5 羟自由基（·OH）含量测定
• 5.2.6 丙二醛（MDA）含量测定
• 5.2.7 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 5.2.8 过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 5.2.9 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定
• 5.2.10 蛋白含量测定
• 5.2.11 统计学分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 PQQ对MeHg导致GSH含量降低的影响
• 2·^-含量升高的影响'>5.3.2 PQQ对MeHg导致O₂·^-含量升高的影响
• 2O₂含量升高的影响'>5.3.3 PQQ对MeHg导致H₂O₂含量升高的影响
• 5.3.4 PQQ对MeHg导致·OH含量升高的影响
• 5.3.5 PQQ对MeHg导致MDA含量升高的影响
• 5.3.6 PQQ对MeHg导致SOD活性降低的影响
• 5.3.7 PQQ对MeHg导致CAT活性降低的影响
• 5.3.8 PQQ对MeHg导致GSH-Px活性降低的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 参考文献
• 结论
• 创新点摘要
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢
• 作者简介