论文摘要
口蹄疫（Foot and Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus,FMDV）引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病,一旦爆发流行会造成巨大的经济损失。3C蛋白是口蹄疫病毒基因编码具有重要功能的蛋白酶,研究其功能、了解其与宿主细胞的关系,将为探索口蹄疫病毒的致病机理和寻找新的抗口蹄疫药物提供思路。本实验从感染口蹄疫病毒的细胞中提取病毒总RNA,设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR技术扩增获得了长约640bp的目的基因;目的基因与pMD18-T simple载体连接,经酶切、PCR及测序鉴定后,回收并亚克隆于表达载体pEGFP-N1中,重组表达质粒pEGFP-3C用酶切、PCR和DNA测序法鉴定。结果表明,获得了完整的口蹄疫病毒3C基因,重组表达质粒pEGFP-3C所含3C基因读码框正确,成功构建了口蹄疫病毒3C基因的重组表达质粒。采用脂质体介导法,用重组质粒pEGFP-3C和空白对照pEGFP-N1转染BHK-21细胞,通过荧光、RT-PCR和Western-blotting进行鉴定。结果显示,pEGFP-3C转染的BHK-21的细胞发出绿色荧光,RT-PCR扩增产物为一条约640bp目的条带,Western-blotting免疫印迹与牛的阳性血清发生免疫反应并出现一条约50ku的条带。证实3C基因在BHK-21细胞得到成功表达。通过形态学、Hoechst荧光染色、DNA Ladder和DNA断裂原位等方法观察和检测重组质粒pEGFP-3C和空白对照pEGFP-N1转染BHK-21细胞的凋亡情况,发现转染pEGFP-3C 24h后,细胞开始发生脱落,48h后大量脱落,细胞核浓缩凝聚成块,荧光致密浓染,出现约180200bp整数倍的DNA梯形带,且DNA断裂原位检测发现细胞核呈现棕黄色。提示口蹄疫病毒3C蛋白能诱导BHK-21细胞凋亡。