论文摘要
研究背景：胶质瘤是临床上最常见,最具侵袭性的原发性脑肿瘤,约占全部颅内肿瘤的40%-50%。胶质瘤具有浸润性生长的特性,瘤灶与周围组织边界不清,极难做到病理意义上的全切除,术后复发率非常高。因血脑屏障的存在限制了抗癌药物进入中枢神经系统,即使放、化疗联合,效果仍不尽如人意。其1年累计生存率只有30%,而恶性胶质母细胞瘤（GBM,Grade Ⅳ）的平均生存时间不到一年。由于颅内病变的部位特殊性,加上手术治疗时不可避免的医源性损伤,生存者多并发神经功能障碍,生活质量低下。此外,各种因素导致的放化疗抵抗,是造成胶质瘤难治性的主要原因。所以,针对胶质瘤高度侵袭性的研究成为目前研究的一大热点,找到放化疗抵抗的关键基因,可能成为治疗胶质瘤,预防胶质瘤复发的有效途径。微RNA （microRNA, miRNA, miR）是一类内源性非编码小分子RNA,它主要通过与靶基因mRNA3’UTR完全或不完全配对,导致靶标mRNA降解或转录后翻译抑制。目前的研究已经证明在多种人类癌症中,miRs能正性或负性调节NF-κB通路,例如胰腺癌中的miR-301a,胃癌中的miR-16和miR-21,卵巢癌中的miR-199a。近年来研究证实,miRNA的表达失控与胶质瘤的发生发展密切相关。但是胶质瘤中miRs与NF-κB的关系鲜有文献报道,胶质瘤发生发展中miRs的作用及分子机制尚未阐明。Novakova J证明在人类癌症中,有些miRs被认为是原癌基因（miR-21, miR-221/222）,有些则是抑癌基因（miR-181a/181b, miR-7, miR-128）。有证据显示microRNA的调节与BAX/Bcl2通路相关。hsa-miR-128的异常表达抑制了一种包含Bax-3’UTR的荧光素酶报告基因,减少了HEK293T细胞中的Bax水平。有报道指出,U87MG胶质瘤细胞中MiR-21的过表达可以通过减少BAX/Bcl-2比例而抑制TMZ诱导的细胞损伤。BNIP3L是Bcl-2家族中BH3-only亚家族成员,也叫做NIX,是由缺氧诱导的。与BNIP3类似,促凋亡蛋白NIX也能与BCL2和BCL-XL相互作用,通过它的C-末端跨膜结构域引起细胞凋亡。促因子NIX也能与BCL2和BCL-XL相互作用,通过它的羧基末端跨膜区引起细胞凋亡。缺氧引起的NIX的调节被认为能延缓肿瘤细胞的生长,而肿瘤缺氧的严重程度关系到肿瘤的恶性度和WHO等级。有报道指出,在缺氧依赖的细胞死亡中,BNIP3和NIX作为肿瘤抑制基因起着重要的作用。缺氧引起的BNIP3/NIX基因产物的显著上调和表达增多在临床肿瘤中被发现。与正常组织相比,肿瘤标本的BNIP3和NIX基因表达水平较高。另一方面,一些证据显示,NIX是Gq依赖的心肌病的效应基因,并能负向调节注射了U20S骨肉瘤细胞的裸鼠的肿瘤生长。本篇文章中,我们研究microRNA miR-520h是否可以与NIX基因相互作用而调节神经胶质瘤的发生发展。目的：本研究旨在通过综合分析肿瘤标本中基因和蛋白表达,体外生物学作用的检测及对临床病例预后的长期随访,来评价胶质瘤中NIX蛋白的生物学作用以及NIX蛋白与microRNA miR-520h的关系。方法：1.选取46例Ⅱ到Ⅳ级胶质瘤标本,包含18例星形神经胶质瘤（WHO Grade Ⅱ）,13例间变性神经胶质瘤（AA, Grade Ⅲ）,15例多形性胶质母细胞瘤（GBM, GradeⅣ）,用定量PCR检测NIX基因的表达；Western blotting检测NIX蛋白的表达。2.常规RT-PCR检测46例胶质瘤瘤标本中前体microRNA （pri-miR-520h）的表达,胶上pri-miR-520h条带标记为Pri（+）,表示前体miR-520h高表达,而成熟的miR-520h低表达；相反,无pri-miR-520h条带的标记为Pri（-）。3.用免疫组织化学方法评估胶质瘤标本Ki-67指数；对患者的预后进行KPS评分及肿瘤复发与相关死亡率监测。4.细胞培养,用含10%FBS,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液,于37℃置于C02培养箱中常规培养U251人神经胶质瘤细胞。隔天换液,待细胞融合率为80%时用含0.02%EDTA的0.25%的胰蛋白酶液消化传代。根据说明书指示,用Lipofectine2000将has-miR-520h抑制剂转染至U251细胞,has-miR-520h抑制剂的最终浓度分别为100nmol/L、200nmol/L。5h后将DNA/脂质体复合物换为含体积分数为10%FBS的DMEM培养基进行培养,正常培养48h后,再缺氧培养6h。收集细胞,提取总蛋白,Western blotting检测NIX, IKKα, i-KBα和p-NF-KB/p65等蛋白的表达水平。结果：1.所有胶质瘤标本中,NIX mRNA在IV级中表达最高（F=15.831,P=0.000）。根据NIX蛋白的Western blot分析,所有的肿瘤显示了NIX表达的多样性,与GAPDH比较,分为NIX（+）组和NIX（-）组。在Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ级病例,NIX（+）的比例分别为：33.3%,30.8%和33.3%。但是,NIX阴性和阳性样本中NIX mRNA水平的显著差异只出现在Ⅱ级病例（t=2.275,P=0.04）,Ⅲ级和Ⅳ级没有这种差别。2.在所有46例肿瘤样品中,有13例为高表达前体miR-520h（pri-miR-520h（+））（28.3%）,包括6例星形胶质瘤（6/18,33.3%）,3例AA（3/13,23.1%）,及4例GBM（4/13,30.8%）。3.免疫组织化学结果及Ki-67阳性率分析显示,Ⅱ级胶质瘤Pri（+）组（2.857±2.115）与Pri（-）组（20.818±23.592）相比具有显著差异（p=0.03）,Ⅳ级胶质瘤Pri（+）组（16.250±11.087）与Pri（-）组（43.181±31.256）相比具有显著差异（p=0.029）。说明高表达前体miR-520h （Pri（+））的病例Ki-67百分比较低；而成熟miR-520h作为有效的肿瘤激活剂,增加了Ki-67百分比。4.长期随访结果显示高表达前体miR-520h （Pri（+））病例预后较好,肿瘤复发和相关死亡率较低。Pri（+）病例的KPS评分显示高表达前体miR-520h（Pri（+））病例预后较好,具有较好的KPS评分p<0.05),说明pri-miR-520h （+）病例预后较好。5.用miR-520h抑制剂转染U251胶质瘤细胞,Western blotting结果显示,200nmol/L的has-miR-520h抑制剂处理细胞后,细胞的NIX蛋白表达（0.962±0.116）和正常对照组（0.366±0.510）比较,显著增强（F=75.716,P=0.000）,而p-NF-kappaB/p65蛋白表达（0.036±0.027）和正常组（0.774±0.037）比较,显著降低（F=32.723,P=0.001）。结论：1.NIX mRNA增加的水平可能是神经胶质瘤病人恶性度的一个分子标致,NIX基因的转录前调节改变了NIX蛋白水平。2.成熟miR-520h具有显著的肿瘤激活作用,高表达前体miR-520h （Pri（+））病例预后较好,肿瘤复发和相关死亡率较低。3.成熟miR-520h可能通过促进NF-kappa B （?）舌性和抑制NIX合成,从而成为一个强大的肿瘤激活剂。
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