论文摘要
【研究背景及目的】据世界卫生组织（WHO）预测:至2025年,我国患肺癌人数将居世界之首,每年新增的肺癌病死例数将超过100万。目前治疗肺癌的主要方法是多学科综合治疗,主要包括手术、化疗、放疗及生物靶向治疗等;这些治疗均是通过不同途径杀伤肿瘤细胞达到治疗目的,但效果不尽如人意,在恶性肿瘤中的肺癌病死率是最高的,5年生存率在我国仅为10%左右。寻找有效的治疗药物和治疗手段是摆在人们面前的一项迫不及待的任务。三氧化二砷是中药砒霜的有效成份,过去中药利用其“以毒攻毒”的原则来治疗牙髓病以及银屑病、梅毒、风湿等疾病,因为有剧毒,临床应用范围十分狭窄;然而自从20世纪七十年代三氧化二砷被用来治疗急性早幼粒细胞性白血病并且获得了较高的缓解率以来;三氧化二砷的抗肿瘤作用同益引起国人的重视。三氧化二砷不仅对急性早幼粒细胞性白血病有效果,对其它类型的白血病以及其他许多恶性肿瘤,如胃癌、前列腺癌、乳腺癌等都有一定的治疗效果。肿瘤的产生与细胞分化异常有关;三氧化二砷可以诱导急性早幼粒细胞分化成为成熟粒细胞,通过阻滞细胞周期影响细胞生长与分化,达到抑制肿瘤的作用;诱导分化治疗副作用小,疗效不比常规化疗差,因此诱导肿瘤分化正成为治疗肿瘤的一种新的热点。如果三氧化二砷对肺癌细胞也有一定的诱导分化作用,则有可能转变肺癌的治疗模式。目前国内外有相关研究证实三氧化二砷对肺癌细胞有一定的细胞周期阻滞和诱导凋亡作用,但研究结果不尽相同,有报道三氧化二砷可以使肺癌细胞周期阻滞于G2/M期也有报道三氧化二砷可以使肺癌细胞周期阻滞于G1期;细胞周期中G1期称为细胞分化期,G1期停滞可作为细胞分化的指标,若能使细胞周期阻滞于G1期,则有可能诱导肺癌细胞分化。与其它细胞毒性药物不同的是,三氧化二砷在部分低氧的实体肿瘤组织中作用仍较明显;而且低氧可以加强三氧化二砷对白血病的诱导分化作用。低氧及厌氧环境对三氧化二砷肺癌细胞周期阻滞作用将产生怎样的影响呢?是否更有利于肺癌细胞分化呢?依托泊苷（VP-16）是白血病和肺癌治疗中常用的药物,可以使肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期,低浓度的VP—16能通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径诱导慢性粒急性变的K562细胞分化。本实验首先在常氧环境下利用三氧化二砷对肺癌A549细胞体外诱导培养,与细胞周期特异性药物依托泊苷（VP-16）作对照,研究三氧化二砷在常氧环境下对肺癌A549细胞周期的作用特点;然后在微缺氧（5%）、厌氧环境观察缺氧对其细胞周期阻滞作用的影响;从G1期阻滞角度来探讨三氧化二砷对肺癌A549细胞可能存在的诱导分化作用,为临床上三氧化二砷治疗肺癌提供理论依据。【实验方法】一、实验分组:根据处理药物不同,将消化后的细胞随机分成1μmol/L三氧化二砷与1.0μmol/L VP-16及空白对照组3个组,接种于24孔板;每组设6个复孔,每孔细胞接种密度约为3*105个/孔。二、细胞培养:分别在常氧环境下体外诱导培养12小时、24小时、48小时;微缺氧、厌氧环境下体外诱导培养24小时,采用厌氧袋发生法制造微缺氧及厌氧环境。三、细胞收取:在各种氧环境下诱导培养至相应时段以后,用含0.25%胰蛋白酶消化液消化各组细胞,收集、离心、弃上清后PBS洗涤、离心、弃上清两次,加入70%冰乙醇固定,4℃过夜。四、流式细胞仪（FCM）检测细胞DNA含量:固定过夜后的细胞,加入PBS振荡洗涤后离心弃上清,加入碘化丙啶（PI）染色,室温避光孵育后进行流式细胞仪检测;每个流式细胞管检测细胞数不低于8000个,低于G1期DNA含量主峰（亚G1期峰）的细胞为凋亡细胞。五、细胞周期分析:采用CellQuest软件进行细胞周期分析,结果以直方图进行表示;并计算出各期细胞比例。六、统计学分析:细胞周期分析结果为百分比形式,以均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析,具体分析方法详见各部分。【结果】（一）、常氧环境As2O3对肺癌A549细胞周期分布及细胞凋亡的作用1、随作用时间的延长,1μmol/L As2O3组G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,作用48小时,G1期细胞比例为47.04%,S期细胞比例为50.54%;与空白对照组相比较,G1期细胞比例明显增加（P＜0.05）,S期细胞比例明显减少（P＜0.05）;与VP-16组比较:G1期细胞比例无明显差异,S期细胞比例较高（P＜0.05）,G2/M期细胞比例明显减少（P＜0.05）。2、1μmol/L As2O3组各时段细胞凋亡率与空白对照组相应时段均无明显差异,但各时段均较同等浓度VP-16组明显减少（P＜0.05）。（二）、不同氧环境As2O3对肺癌A549细胞周期分布及细胞凋亡的作用1、随缺氧加重,1μmol/LAs2O3组G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,与常氧、微缺氧环境相比,厌氧环境G1期、G2/M期细胞比例显著增加（P＜0.05）S期细胞比例显著降低（P＜0.05）;与空白对照组比较,微缺氧环境G1期、S期细胞比例无明显差异,厌氧环境G1期细胞比例明显增加（P＜0.05）、S期细胞比例明显减少（P＜0.05）;与VP-16组相比较:三种氧环境下各期细胞比例均有明显差异,G1期、G2/M期细胞比例减少（P＜0.05）,S期细胞比例增加（P＜0.05）。2、与1μmol/LVP-16组相比较,As2O3组各种氧环境下细胞凋亡率均明显减少（P＜0.05）;与空白对照组相比较,常氧及微缺氧环境无明显差异,厌氧环境反而降低（P＜0.05）。【结论】一、低浓度三氧化二砷对肺癌A549细胞G1期的阻滞作用具有一定的时-效效应;随缺氧加重,G1期阻滞作用增强;低氧环境下延长作用时间有可能诱导A549细胞分化。二、低浓度三氧化二砷对肺癌A549细胞周期的特异性阻滞作用不及同一浓度VP-16强,对A549细胞无明显诱导凋亡作用。
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