论文摘要
研究背景和目的螺杆菌属（genus Helicobacter）是一组革兰氏染色阴性、微需氧、螺旋弯曲状细菌,按照主要定植部位及16S rRNA、23S rRNA的不同,可分为胃螺杆菌（如H. pylori）与肝肠螺杆菌（如H. hepaticus、H. bilis）。肝肠螺杆菌的主要定植部位虽然有别于胃螺杆菌（主要为人类、其他哺乳动物和鸟类的肠道、肝脏及胆道）,却与胃螺杆菌有着相似的超微结构和生化功能。1983年Warren和Marshall首次从人的胃粘膜中分离出H. pylori,当时有学者否认其为致病菌,现H. pylori已被证明是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病的主要致病因子,并被世界卫生组织列为Ⅰ类生物致癌因子。1992年Lee等首次分离并报道了一种定植在小鼠和大鼠肠黏膜的肝肠螺杆菌——H.muridarum,近二十年来陆续有其他类型的肝肠螺杆菌从动物或人中分离出来,如H. hepaticus、H. bilis、H. muridarum、H. rodentium、H. typhlonicus等。国内外学者通过对实验动物、野生动物及宠物的流行病学调查发现肝肠螺杆菌感染普遍存在。学者们对肝肠螺杆菌致病性的认识也经历了类似认识H. pylori一样的过程：肝肠螺杆菌曾一度被认为是正常菌群,但随着研究的深入,学者们已发现部分肝肠螺杆菌,甚至可能是全部的肝肠螺杆菌,能使具有免疫活性或免疫缺陷的啮齿动物致病。胆型螺杆菌（Helicobacter bilis,H. bilis）是一种重要的肝肠螺杆菌,光镜下为革兰氏染色阴性,海鸥形或弧形弯曲的细菌,电镜下可见3～14根含鞘的两极鞭毛,十字交叉状的周质纤毛紧紧缠绕在菌体周围,长约3μm～4μm,宽约02μm～0.4μm。H. bilis可使硝酸盐转变为亚硝酸盐,具有很强的尿素酶活性,过氧化氢酶、亚硝酸盐及硫化氢试验呈阳性,吲哚酚醋酸盐及马尿酸水解试验呈阴性。H. bilis生长于37℃或42℃的微需氧环境中,也能生长在1%～20%的胆汁或1%的甘氨酸中,不会使血琼脂发生溶血反应或产生黄色色素。H. bilis对头孢霉素、萘啶酸抗药,对甲硝唑敏感。目前,国内外对肝肠螺杆菌的研究多集中于肝螺杆菌（H. hepaticus）,对胆型螺杆菌（H. bilis）的研究相对不足,检测方法的选择尚存争议。动物实验已证实肝肠螺杆菌感染与小鼠的盲肠结肠炎、肝炎、肝癌、胆囊炎等疾病的发生发展有关,这类细菌与人类消化系统疾病的关联仍不清楚。针对这些问题,本课题分两个部分进行：第一部分用H. bilis标准株ATCC51630感染不同品种的实验室小鼠,通过分离培养、粪便聚合酶链式反应（PCR）及酶联免疫吸附法（ELISA）分析监测感染,比较这三种方法的效用；第二部分通过对胆石症、胆囊息肉、胆管癌、肝细胞癌及肝转移瘤患者胆汁中肝肠螺杆菌16S rRNA基因扩增阳性率和抗体阳性率进行调查,探讨肝肠螺杆菌感染在这些肝胆疾病发生发展过程中可能的致病作用。材料和方法第一部分：选取经检验无H. bilis感染的SPF级雄性BALB/C.C57BL/6、 KM、NIH及SCID小鼠各12只,分为实验组和对照组（每组每种小鼠各6只）。实验组小鼠用0.1mL（1×106CFU/mL）的H. bilis标准株ATCC51630菌液灌胃,连续3次,每次间隔48小时；对照组用等量PBS行同样处理。收集末次灌饲H. bilis后第1、3、5、7、9、11、13、15周时每组小鼠的粪便标本,对标本分别进行以下三种处理。①用哥伦比亚选择性血培养基（含万古霉素,两性霉素B,多粘菌素,TMP及脱纤维羊血）,在37-C、高湿度、微需氧（5% O2,5% H2, 10% CO2,80% N2）的条件下培养标本,培养3d后,每天观察有无菌落生长,共观察14d。将典型螺杆菌菌落进行水涂片行Gram’s染色于光镜检查、扫描电镜观察超微结构、生化鉴定、特异性基因PCR扩增以及传代培养观察。②用粪便基因组DNA提取试剂盒提取DNA,合成H. bilis特异性16S rRNA引物及螺杆菌特异性16S rRNA引物进行PCR扩增,凝胶电泳并于紫外成像系统下观察并拍照记录,并对PCR阳性产物进行纯化后进行DNA片段测序,与Genebank上已知的H. bilis基因序列进行比对。③将H.bilis标准菌株ATCC51630进行超声粉碎制备全菌抗原,利用全菌抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,纯化抗体后测定其蛋白浓度,并用抗体包被酶标板,再行ELISA法检测粪便中H.bilis抗原,并设置阳性与阴性对照。灌胃后15周后,行颈椎脱臼法处死全部实验小鼠,取得其胃、肝脏、胰腺、空肠、回肠、盲肠和结肠等组织进行组织病理学检查。第二部分：选择2011年1月至2013年1月期间就诊于南方医科大学南方医院的肝胆疾病病例共223例（男134例,女89例,平均49.8岁）,所有病例均由组织病理学确诊,包括胆石症95例,胆囊息肉11例,胆管癌27例,肝细胞癌59例及肝转移瘤31例。经手术或ERCP获得每位患者的胆汁标本,均分为三份：1份行细菌分离培养；1份用特定16S rRNA引物的PCR检测螺杆菌属特异性16S rRNA基因、H. hepaticus特异性16S rRNA基因、H.bilis特异性16S rRNA基因及H. pylori特异性UreaseA基因,并将阳性PCR产物进行DNA片段测序,与Genebank上已知的螺杆菌属基因序列进行比对,再随机选取部分阳性标本行TA克隆测序；1份用ELISA检测抗H. hepaticus抗体、抗H. bilis抗体及抗H. pylori抗体。三种检测中有其中一项阳性者即认为胆汁中存在H. hepaticus（或H. bilis、H. pylori）感染。使用χ2检验或Fisher确切概率法比较标本阳性率的差异。结果第一部分：①粪便分离培养H. bilis检出率：实验组部分BALB/C小鼠与SCID小鼠在感染第3周时的粪便即培养出H. bilis,远远早于KM小鼠（第7周）、NIH小鼠（第7周）和C57BL/6小鼠（第9周）。SCID小鼠的培养阳性率在第7-15周时保持在66.7%～100%之间,BALB/C小鼠的培养阳性率在第11～15周时保持在66.7%～83.3%之间,KM小鼠和NIH小鼠的培养阳性率自检出后则保持在较低水平（33.30%～50%之间）,C57BL/6阳性率最低,并于第15周时未能培养出H. bilis。PBS对照组的粪便在各个时期均未分离出H. bilis。②粪便PCR H. bilis特异性16S rRNA基因检出率：实验组部分BALB/C小鼠与SCID小鼠在感染第1周时的粪便行PCR即检出H. bilis特异性16S rRNA基因,KM小鼠、NIH小鼠和C57BL/6小鼠也于第7周时检出。SCID小鼠的基因检出率在第3～15周时保持在66.7%～100%之间,BALB/C、鼠的基因检出率在第7～15周时保持在66.7%100%之间,KM小鼠和NIH小鼠的基因检出率较培养阳性率明显增高,分别在第7～15周,第9～15周维持在66.7%～100%之间。C57BL/6的基因检出率在第11周达100%,第15周时却降为33.3%。PBS对照组的粪便行PCR在各期均未检出H.bilis特异性16S rRNA基因。③粪便H.bilis抗原检出率：实验组部分BALB/C小鼠与SCID小鼠在感染第1周时的粪便行ELISA即检出H.bilis抗原,KM小鼠、NIH小鼠和C57BL/6小鼠也于第7周时检出。SCID、鼠的抗原阳性率在第5～15周时保持在83.3%～100%之间,BALB/C小鼠的抗原阳性率在第9～15周时保持在83.3%～100%之间,KM小鼠和NIH小鼠的抗原阳性率较培养阳性率明显增高,分别在第9～15周,第11～15周维持在66.7%～83.3%之间。C57BL/6的基因检出率在第11周达最高峰（66.7%）,第15周时降为33.3%。PBS对照组的粪便行ELISA均未检出H. bilis抗原。④小鼠各消化器官组织病理学检查：实验组病理结果炎症轻重程度依次为SCID>BALB/CNIH>C57BL/6小鼠。PBS对照组各小鼠的各个消化器官肉眼及镜下观察均未发现明显炎症变化。第二部分：223例胆汁标本中均未分类培养出螺杆菌。95例胆石症患者胆汁中H. hepaticus阳性28例（29.5%）,H. bilis阳性23例（24.2%）,H. pylori阳性63例（66.3%）；11例胆囊息肉患者胆汁中H. hepaticus阳性1例（9.1%）,H. bilis未检测出,H. pylori阳性4例（36.4%）；27例胆管癌患者胆汁中H. hepaticus阳性12例（44.4%）,H. bilis阳性14例（51.9%）,H. pylori阳性20例（74.1%）；59例肝细胞癌患者胆汁中H. hepaticus阳性16例（27.1%）,H. bilis阳性7例（11.9%）,H. pylori阳性37例（62.7%）；31例肝转移瘤患者胆汁中H. hepaticus阳性3例（9.7%）,H. bilis阳性2例（6.5%）,H. pylori阳性15例（48.4%）。螺杆菌属感染在5种疾病中的差异有统计学差异（P<0.05）,可认为5种疾病在螺杆菌的感染率有差别。H. hepaticus感染在5种疾病中的差异有统计学差异（P<0.05）,可认为在5种疾病中的感染率有差别。H. bilis感染在5种疾病中有的差异有统计学意义（P<0.05）,可认为在5种疾病感染率有差别。H. pylori感染在5种疾病中的差异没有统计学意义（P>0.05）,可认为5种疾病的感染率没有明显差别。结论第一部分：利用低浓度H.bilis灌饲BALB/C、C57BL/6、KM、NIH及SCID小鼠构建的模型中,以SCID小鼠最为适合,BALB/C小鼠次之,C57BL/6则对H. bilis有一定抗性。粪便培养、粪便H. bilis特异性16S rRNA基因PCR扩增和粪便H. bilis抗原ELISA分析均能检测到H. bilis感染,其中以PCR最为敏感,ELISA次之,且分离培养首次发现感染的时间晚于PCR和ELISA。小鼠各消化器官组织病理学检查：实验组病理结果炎症轻重程度依次为SCID >BALB/C>KM>NIH>C57BL/6小鼠。第二部分：胆石症、胆囊息肉、胆管癌、肝细胞癌及肝转移瘤这几种肝胆系统常见良恶性疾病患者的胆汁中存在H. hepaticus、H.bilis相关性基因或抗体在不同类型疾病的感染率也有差异,而H. pylori相关性基因或抗体在不同类型疾病的感染率无明显差异,提示肝肠螺杆菌感染可能与这些肝胆疾病的发病机制存在一定联系。