家蚕microRNA的计算机鉴定及分析

论文摘要

microRNAs（miRNAs）是一类长约22nt的内源非编码小分子RNA,在线虫、果蝇、家鼠、人及拟难芥等生物中普遍存在。研究表明,这些miRNA作为一种真核生物体内的重要的调节因子,在生物体内发挥着重要的调节作用,并影响着生物体生命活动的各个方面。虽然目前通过实验和计算机的方法在植物和动物中发现了众多miRNA分子,但是在各个物种中所鉴定的miRNA的数量远不及理论上的饱和值,所以对miRNA的分离鉴定依然是miRNA研究的一个热点。近年来,随着人类基因组和许多模式生物基因组测序工作的完成,利用计算机搜索miRNA的方法逐渐普及。动物miRNA基因在进化上具有高度的保守性,许多序列都可以在亲缘关系相近的物种中找到,甚至在亲缘关系较远的物种中都有发现。因而,我们可以利用已鉴定的种子序列,通过生物信息学同源性搜索的方法来搜寻家蚕的miRNA基因及其作用靶标。这有助于我们进一步了解miRNA对家蚕生长发育的影响与作用,有利于通过基因工程手段改良家蚕的品种与质量,选育更高产的家蚕品种,从而增加经济效益。本文采用计算机RNA组学和实验RNA组学相结合的方法,利用成熟miRNA的序列保守性以及前体结构具有发夹二级结构的特性在家蚕基因组中搜寻保守的家蚕miRNA分子,然后采用RT-PCR手段对预测结果进行验证,并观察它们在不同组织中的表达情况。现将研究结果小结如下:1.在数据库中共搜寻出62条保守的家蚕miRNA候选分子,通过mfold分析所有预测的miRNA序列是否能够形成符合miRNA标准的发夹环状二级结构。折叠结果表明,绝大多数序列能够形成典型的发夹结构。这些miRNA候选分子与已知黑腹果蝇的miRNA有着高度同源性。2.在研究家蚕miRNA分子中,发现在所预测的候选分子中有33个仅存在于节肢动物中的miRNA分子,如miR-965、miR-993和miR-1000。通过比对分析发现,它们的成熟序列和前体都较为保守。3.通过分析发现家蚕基因组中这62个与果蝇miRNA同源的序列形成40个基因家族。其中miR-2、miR-9、miR-25和miR-263家族分别有5、3、2和2个成员,而大多数miRNA家族,例如miR-305,miR-275,miR-iab-4家族都只有一个成员。这与植物miRNA形成家族的形式完全相反。动物家族成员之间通常是多拷贝或者是序列同源的。4.对所有的62个miRNA进行序列分析,发现其中20个miRNA分子形成8个基因簇。其中最大的基因簇由5个基因组成的。这些簇的序列比对表明,这8个miRNA簇都是由同源的miRNA分子所组成,且在黑腹果蝇中,这些分子也相应成簇。5.对所鉴定的miRNA靶序列的预测分析表明,这10个miRNA所调节的靶序列参与了家蚕生命活动中一些非常重要的过程,比如变态发育、细胞凋亡和信号转导作用等等。这些靶基因包括激素调控途径中的调控因子,如保幼激素酯酶等;细胞周期调控因子,如凋亡抑制蛋白等;以及信号传导调节因子,如凋亡信号调节激酶等。这些不同的靶分子显示了miRNA在细胞各种不同的生理活动中都扮演着重要的角色。6.通过对4条miRNA候选分子进行RT-PCR分析,发现miRNA在不同组织中存在着特异性表达情况,如miR-iab-4as,分析结果表明这些miRNA分子在家蚕生长发育过程中的存在着不同水平的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 综述
• 1.1 引言
• 1.2 miRNA基因
• 1.2.1 miRNA的发现过程
• 1.2.2 miRNA的特征
• 1.3 miRNA的生物合成
• 1.3.1 动物miRNA的生物合成
• 1.3.2 植物miRNA的生物合成
• 1.4 miRNA的作用机制
• 1.4.1 miRNA对靶基因转录体的切割
• 1.4.2 miRNA对靶基因转录体的抑制
• 1.4.3 miRNA与siRNA的异同
• 1.5 miRNA的生物学功能
• 1.5.1 miRNA在动物中的作用
• 1.5.2 miRNA在植物中的作用
• 1.5.3 miRNA与肿瘤
• 1.6 miRNA的界定与命名
• 1.6.1 miRNA的界定
• 1.6.2 miRNA的命名
• 1.7 miRNA及其靶基因的鉴定
• 1.7.1 miRNA的鉴定
• 1.7.2 miRNA靶基因的鉴定
• 1.8 本论文的研究目的与意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 使用的数据库及分析软件
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.3 主要的仪器和设备
• 2.1.4 PCR引物
• 2.1.5 主要的酶和试剂
• 2.1.6 主要的缓冲液和试剂的成分及配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 miRNA的计算机分析
• 2.2.2 家蚕总RNA的提取
• 2.2.3 家蚕基因组DNA的提取
• 2.2.4 总RNA中的DNA的酶解
• 2.2.5 RNA的逆转录反应
• 2.2.6 PCR反应及其产物鉴定
• 第3章 结果与分析
• 3.1 家蚕miRNA的计算机预测
• 3.2 节肢动物特有的miRNA分子
• 3.3 miR-2基因家族的分析
• 3.4 家蚕miRNA基因功能预测与分析
• 3.5 miRNA的表达分析
• 3.5.1 家蚕总RNA提取结果
• 3.5.2 家蚕基因组DNA提取结果
• 3.5.3 RT-PCR结果
• 第4章 讨论
• 4.1 计算机RNA组学与实验RNA组学在研究miRNA中的重要意义
• 4.2 miRNA保守性分析
• 4.3 miRNA进化的机制
• 4.4 miRNA的功能分析
• 4.5 miRNA组织表达特异性
• 致谢
• 参考文献
• 附录A miRbase已公布的家蚕miRNA分子
• 附录B 预测miRNA靶序列的相关软件
• 附录C 缩略词
• 攻读学位期间的研究成果