猪圆环病毒ⅡRep启动子功能分析及感染性克隆的构建

论文摘要

【目的】猪圆环病毒（PCV）分两个血清型PCV1和PCV2。PCV2与猪群中发生的多种疾病有关,其中断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）危害最为严重,给各国养猪业造成了巨大损失。因此,探讨PCV2的致病机理对于PCV2相关疾病的防治具有重要意义。本研究通过分离株PCV2-DT接种健康仔猪尝试复制PMWS病例,以虫荧光素酶为报告基因进行PCV2的Rep、Cap启动子定位,Rep启动子上类干扰素刺激应答元件（vISRE）功能分析,构建PCV2感染性克隆及带HA-Tag的重组PCV2,为研究PCV2的体外增殖与致病性、致病机理以及疫苗研发、分子诊断研究等奠定基础。【方法】（1）用PK-15细胞从东台市某猪场病料中分离获得PCV2-DT毒株,进行其基因组序列分析,并接种病毒于42日龄健康仔猪（无PCV1、PPV、PRV、PRRSV等感染）进行感染试验。（2）用Promotor Prediction软件预测PCV2-DT株的启动子位置,PCR扩增预测启动子片段后定向克隆于pGL3-Basic载体,构建重组载体pGL3-Bp1、pGL3-Bp2、pGL3-Bp3、pGL3-Bp4以及已知序列的PCV1 Rep启动子的重组载体pGL3-Bp5,各重组质粒分别转染PK-15细胞后,以Luciferase Assay System测定各预测启动子片段活性的有无及强弱。（3）将含PCV1和PCV2 Rep启动子的重组质粒pGL3-Bp5、pGL3-Bp2,以及对PCV2 Rep启动子上vISRE实施定点突变而构建的重组载体pGL3-Bpm,分别转染PK-15细胞,用不同剂量α-IFN刺激后测定启动子的活性变化。（4）将PCV2双拷贝基因正向串联克隆于载体pSK（+）,构建重组质粒pSK-2PCV2,转染PK-15细胞,盲传4代后,用RT-PCR和IFA方法检测有无病毒粒子产生。（5）用SOE-PCR方法将HA-Tag基因插入到PCV2 Cap蛋白终止密码子前面,环化扩增的线性病毒基因组（Circo-DNA-HA）后转染PK-15细胞,盲传4代用RT-PCR、IPMA、扩增相应片段测序、血凝试验等方法进行重组PCV2-HA病毒粒子检测及其HA-Tag的稳定性检测。【结果】（1）成功分离到PCV2-DT株,其与国内外35株分离株的同源性均在95%以上,仅存在一些点突变,由进化树可见PCV2各毒株之间没有明显的地域性。PCV2-DT株接种仔猪10d后呈现PMWS症状。（2）初步测定,PCV2 Rep启动子位于1705nt～1968nt,Cap启动子位于834nt～1309nt,且活性均高于对照组的SV40启动子。（3）α-IFN可使各启动子活性受到不同程度地抑制,PCV2 Rep启动子的活性与α-IFN剂量正相关,但不同剂量的α-IFN对PCV1 Rep启动子的活性影响不明显。PCV2 Rep启动子上vISRE实施突变后活性减弱,而且对α-IFN的作用不敏感。无论突变与否,高剂量的α-IFN均对Rep启动子具有极强的抑制作用。（4）pSK-2PCV2转染PK-15细胞,盲传4代后经RT-PCR、IFA检测有病毒粒子产生。（5）Circo-DNA-HA转染PK-15细胞,盲传4代后经RT-PCR、IPMA、克隆测序、血凝试验检测有带HA-Tag的重组PCV2-HA的病毒粒子产生,但该病毒不具有血凝活性。【结论】（1）本次分离的PCV2-DT株与国内外35株分离株同源性均很高,仅存在一些点突变。PCV2-DT能够导致仔猪出现PMWS症状。（2）用虫荧光素酶为报告基因成功地对PCV2 Rep、Cap启动子进行初步定位。（3）α-IFN对PCV Rep启动子的活性具有抑制作用,通过vISRE对病毒复制可能具有调节作用。（4）含PCV2正向串联双拷贝基因组的重组质粒pSK-2PCV2具有感染性,转染PK-15细胞可产生病毒粒子。（5）Circo-DNA-HA具有感染性,转染PK-15细胞可获得带HA-Tag的重组PCV2-HA。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 绪论
• 1 猪圆环病毒（PCV）国内外研究现状
• 1.1 病毒的分类、形态和结构
• 1.2 基因组特点
• 1.3 主要ORFs 及其编码蛋白
• 1.3.1 Rep 蛋白
• 1.3.2 Cap 蛋白
• 1.4 PCV2 的宿主细胞及其对淋巴细胞的影响
• 1.4.1 PCV 的靶细胞
• 1.4.2 PCV 对淋巴细胞和细胞因子的影响
• 1.5 与PCV2 有关疾病
• 1.5.1 断奶仔猪多系统衰竭综合症
• 1.5.2 猪皮炎肾病综合征
• 1.5.3 繁殖障碍
• 1.5.4 A2 型先天性震颤
• 1.5.5 猪呼吸道病复合征
• 1.5.6 猪增生性和坏死性肺炎
• 1.6 感染性核酸的研究进展
• 2 研究的目的和意义
• 3 研究的内容和方法
• 第二章 猪圆环病毒Ⅱ型 DT 株的分离鉴定及动物感染实验
• 1 材料与方法
• 1.1 病料、主要试剂、质粒、菌种、细胞
• 1.2 引物
• 1.3 病料基因组的提取
• 1.4 病料中PCV 病毒的 PCR 检测
• 1.5 间接免疫荧光鉴定 PCV2
• 1.6 PCV2 病毒的分离及其基因组提取
• 1.7 PCV2 全基因组的扩增、克隆与酶切鉴定
• 1.8 测序鉴定及序列分析
• 1.9 PMWS 动物模型的建立
• 2 结果
• 2.1 病料中PCV 的 PCR 检测
• 2.2 病料中PCV2 的间接免疫荧光鉴定
• 2.3 PCV2 全长基因的克隆及阳性重组载体的构建
• 2.4 序列同源性分析
• 2.4.1 PCV2-DT 株与世界其他地区 PCV2 分离株序列的同源性分析
• 2.4.2 PCV2-DT 株与我国不同地区 PCV2 分离株序列同源性分析
• 2.5 PMWS 动物模型的建立
• 3 讨论
• 第三章 Rep、 Cap 启动子定位及 Rep 启动子上vISRE 功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞、病毒、质粒、菌种和主要试剂
• 1.1.2 引物设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 圆环病毒Ⅱ东台株和圆环病毒Ⅰ基因组的提取
• 1.2.2 各预测启动子片断 P1、P2、P3、P4、P5、Pm 的扩增及回收
• 1.2.3 将各扩增片段定向克隆于载体pGL3-Basic 中
• 1.2.4 宿主菌 DH5α感受态细胞的制备
• 1.2.5 连接产物转化
• 1.2.6 小量碱裂解法提取质粒
• 1.2.7 所提质粒的双酶切鉴定
• 1.2.8 重组质粒、对照质粒的制备
• 1.2.9 重组质粒瞬时转染 PK-15 细胞
• 1.2.10 α-IFN 对 PCV Rep 启动子的影响
• 1.2.11 虫荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性分析
• 2 结果
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 重组质粒的XhoⅠ和HindⅢ双酶切鉴定结果
• 2.3 启动子活性测定结果
• 2.4 PCV1 和 PCV2 Rep 启动子用α-IFN 处理后，活性变化情况
• 3 讨论
• 第四章 PCV2 及 HA- Tag PCV2 感染性克隆的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞、病毒、质粒、菌种
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 引物设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 圆环病毒Ⅱ东台株（PCV2-DT）基因组的提取
• 1.2.2 含单拷贝 PCV2 全长基因重组载体pSK-PCV2 的构建与鉴定
• 1.2.3 含双拷贝 PCV2 长基因重组载体pSK-2PCV2 的构建与鉴定
• 1.2.4 含 HA-Tag 重组质粒pSK-PCV2-HA1 的构建
• 1.2.5 含 HA-Tag 标签重组质粒pSK-PCV2-HA2 的构建与鉴定
• 1.2.6 阳性质粒pSK-PCV2、pSK-2PCV2、pSK-PCV2-HA2 的大量制备
• 1.2.7 含 HA-Tag 标签 PCV2 环型基因（Circo-DNA-HA）制备
• 1.2.8 pSK-PCV2、pSK-2PCV2 和 Circo-DNA-HA 分别瞬时转染 PK-15 细胞
• 1.2.9 被转染细胞总 RNA 的提取
• 1.2.10 被转染细胞的 RT-PCR 鉴定
• 1.2.11 质粒pSK-PCV2、pSK-2PCV2 转染细胞的 IFA 鉴定
• 1.2.12 Circo-DNA-HA 染细胞的 IPMA 鉴定
• 1.2.13 HA-Tag 稳定性鉴定
• 2 结果
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.1.1 PCV2 全长基因的扩增结果
• 2.1.2 基因片段 XholⅠS-PHA 和 PHS-PEcoRⅤA 的扩增结果
• 2.1.3 含 HA-Tag 标签 XholⅠS-PEcoRⅤA 基因片段的扩增结果
• 2.1.4 含 HA 标签的 PCV2 全长基因的扩增结果
• 2.2 各重组质粒的酶切鉴定结果
• 2.2.1 重组质粒pSK-PCV2 的酶切鉴定结果
• 2.2.2 重组质粒pSK-2PCV2 的酶切鉴定结果
• 2.2.3 质粒pSK-PCV2-HA1 的 NcoⅠ酶切鉴定结果
• 2.2.4 pSK-PCV2-HA2 的酶切鉴定
• 2.3 PSK-PCV2、PSK-2PCV2、Circo-DNA-HA 转染 PK-15 细胞的RT-PCR 检测结果
• 2.4 PSK-2PCV2 转染 PK-15 后 PCV2 病毒的 IFA 鉴定结果
• 2.5 Circo-DNA-HA 转染细胞的 IPMA 鉴定结果
• 2.6 PCV2-HA 病毒中标签 HA 稳定性检测结果
• 2.7 血凝试验结果
• 3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录1:质粒 PSK-2PCV2、PSK-PCV2-HA2 的构建示意图
• 附录2:缩写词英汉对照表
• 作者简介
• 导师简介