纳豆激酶结构与功能的研究

论文题目: 纳豆激酶结构与功能的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 郑忠亮

导师: 邹国林

关键词: 纳豆激酶,枯草杆菌蛋白酶,结构,功能,催化机理,氢键作用

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本文综合利用了多学科的方法和技术,对纳豆激酶(Nattokinase,NK)的结构和功能进行了研究。首先利用生物信息学的技术,分析了NK的aprN基因,发现NK是由信号肽、前导肽和成熟肽序列构成。aprN基因的热动力学研究发现,NK的热动力学稳定,非常适合进行分子生物学的研究。分析NK的全氨基酸序列发现,在7～29个氨基酸序列区域,亲水性打分和疏水性打分都呈连续性分布,可见此区域定是NK的信号肽区域。根据NK的氨基酸序列,预测了它的二级结构以及三级结构。并利用同源模建技术,构建了NK分子的三维空间结构模型。此模型通过了立体化学、残基能量分布以及残基包装等特性的评估,具有很高的可信度。因此可以知道,NK成熟肽主要由12个β折叠和6个α螺旋构成。内部结构域主要由6个β折叠片组成的折叠桶和2个α螺旋构成。基于此模型结构,NK的最适底物H-D-VLK-pNA被对接到了NK的活性中心。分析此底物和NK分子活性中心的相互作用,发现NK对此最适底物的结合位点应该是五个位点(G102,Y104,I107,G127和E156)。进一步分析此底物和NK分子活性中心残基之间的氢键相互作用,提出了一个不同于经典教科书上的丝氨酸蛋白酶催化理论的新机理。该机理更强调微碱性环境中的[OH~-]作为亲核试剂的可能性,而经典的理论强调是S221作为亲核试剂水解肽键。进一步研究了NK活性中心附近的氢键对催化三联体(D32,H64,S221)以及羟基阴离子洞(N155)的重要性。经过对NK分子模型的深入分析,我们发现在NK分子活性中心周围有四个位点(S33,D60,S62,和T220)是非常重要的。首先利用分子生物学技术,将这四个位点分别突变成丙氨酸。然后用酶动力学方、法

论文目录:

第一章枯草杆菌蛋白酶工程研究进展

1.1 前言

1.2 枯草杆菌蛋白酶的三维结构

1.3 底物专一性和催化机理

1.4 作用力与性能预测

1.5 稳定性

1.6 蛋白质工程技术——酶的体外进化

1.6.1 定向进化的原理

1.6.2 随机突变的策略

1.6.2.1 易错PCR

1.6.2.2 DNA改组和外显子改组

1.6.2.3 杂合酶

1.6.2.4 体外随机引发重组

1.6.2.5 交错延伸

1.6.2.6 酶法体外随机一定位诱变

1.6.3 定向进化的选择策略

1.6.4 定向进化的优势、现状和未来

1.7 蛋白质工程分析技术——生物信息学

1.7.1 数据库

1.7.2 基因组

1.7.3 基因组序列分析

1.7.4 蛋白质结构与功能预测

1.7.5 基因多肽分析与药物设计

1.7.6 分子进化

1.7.7 基于遗传的流行病

1.8 NK研究进展

1.9 问题和前景

第二章 NK的DNA序列分析

2.1 前言

2.2 方法

2.2.1 NK的DNA序列的检索

2.2.2 NK的DNA序列的基本分析

2.2.2.1 分子质量、碱基组成、碱基分布

2.2.2.2 限制性酶切分析

2.2.3 DNA序列之间的多重比对分析

2.2.3.1 基于NCBI／BLAST软件的DNA序列同源性分析

2.2.3.2 什么是BLAST中的E-value

2.2.3.3 进化分析

2.3 结果

2.3.1 NK基因的DNA序列

2.3.2 NK基因的基本性质

2.3.3 NK基因的同源性和进化

2.4 讨论

第三章 NK分子三维空间结构的同源模建

3.1 前言

3.2 方法

3.2.1 NK的基本性质分析

3.2.1.1 疏水性分析

3.2.1.2 跨膜区分析

3.2.2 NK分子结构预测

3.2.2.1 PDB数据库

3.2.2.2 NK氨基酸序列的同源性分析

3.2.2.3 NK分子二级结构预测

3.2.2.4 NK分子三级结构预测

3.2.2.3.1 与已知结构的序列做同源比对

3.2.2.3.2 同源模建

3.2.2.3.2 能量最小化

3.2.3 结构合理性评估

3.2.3.1 PROCHECK-

3.2.3.2 PROSA2003

3.2.3.3 WHATIF5

3.3 结果

3.3.1 NK的基本性质

3.3.2 NK的分子结构

3.3.3 NK分子结构模型的结构合理性

3.4 讨论

第四章 NK的催化机理

4.1 前言

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 NK活性中心附近的氢键对催化活性的影响

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 方法

5.2.2.1 NK的克隆与定点突变

5.2.2.1.1 NK基因组DNA的提取

5.2.2.1.2 质粒DNA的小量制备

5.2.2.1.3 低熔点琼脂糖法回收DNA

5.2.2.1.4 DNA的连接反应

5.2.2.1.5 用CaCl_2法制备和转化大肠杆菌感受态细胞

5.2.2.1.6 NK重组表达载体的构建

5.2.2.1.7 重组蛋白的表达

5.2.2.1.8 重组蛋白的纯化

5.2.2.1.9 NK提取液活力测定——四肽底物法

5.2.2.1.10 重叠延伸法定点诱变NK成熟肽基因

5.2.2.1.11 NK的酶促反应动力学研究

5.2.2.2 NK扰动自由能的计算模拟

5.2.2.3 NK分子动力学模拟

5.3 结果

5.3.1 重组表达质粒pET28a+aprN的鉴定

5.3.2 重组蛋白NK成熟肽的表达

5.3.3 野生型NK及其突变型NK的酶动力学常数

5.3.4 野生型NK及其突变型NK的FEP模拟

5.3.5 野生型NK及其突变型NK的活性中心的分子动力学轨迹

5.3.5.1 自由酶(E)的分子动力学轨迹

5.3.5.2 结合底物后的酶(ES)的分子动力学轨迹

5.4 讨论

5.4.1 突变位点的设计

5.4.2 S33，D60，S62和T220四个位点对催化活性的影响

5.4.2.1 S33位点对NK催化活性的影响

5.4.2.2 S62位点对NK催化活性的影响

5.4.2.3 D60位点对NK催化活性的影响

5.4.2.4 T221位点对NK催化活性的影响

5.5 结论

研究总结

参考文献

博士研究生在读期间已发表和待发表的论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

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[4].优化设计并人工合成的纳豆激酶基因在甜瓜和番茄中的高效表达[D]. 韩岚.内蒙古大学2015
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[7].纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达[D]. 刘朔.南京农业大学2007
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