论文摘要
背景与目的FAT10又被称为双泛素（diubiquitin），属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白（UBLs），是一个分子量为18kDa的包含165个氨基酸残基的蛋白质，由两个泛素样结构域融合而成。FAT10在细胞周期的调控中起到十分重要作用，已被证明能与人纺锤体聚集检测点蛋白（mitotic arrest deficiency 2，MAD2）非共价结合，而此蛋白负责在有丝分裂时保持纺锤体的完整性，MAD2功能受到抑制则导致染色体不稳定，这是许多肿瘤发生的重要特征。已有发现肝癌、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌及小肠腺癌等FAT10表达明显上调，表明FAT10在肿瘤发生中起到一定作用。p53基因是一种肿瘤抑制基因，定位于人类17号染色体短臂，分为野生型p53（wt-p53）和突变型p53（mt-p53）两种，编码p53蛋白。人类一半以上恶性肿瘤都显示出p53基因突变或p53蛋白缺失。p53的突变在胃癌发生发展中也发挥着重要作用，许多研究均表明p53基因突变是胃癌发生发展的重要始动因素之一。最近研究发现FAT10启动子活性和表达在有野生型p53基因的细胞中比在p53基因缺失的受到更显著的抑制，表明p53基因存在使得FAT10基因表达下调。由于p53基因在体内结合于5′端的位点有一半共有系列定位于FAT10启动子，所以提出FAT10是p53基因的下游靶点，在p53基因缺陷细胞中FAT10基因表达的失调可能会导致肿瘤发生。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，中国男、女性胃癌世界调整死亡率居于首位。随着分子生物学技术的发展和应用，人们对胃癌发病机制的探讨已深入到基因水平，但至今未找到胃癌特异的分子病理学标志物。新近研究发现FAT10极有可能是胃癌发生的另一“元凶”。以往研究主要注重于FAT10的结构、表达产物的特征、诱导因子及其基本功能，但有关FAT10在胃癌组织中的表达、与临床病理学特征关系及其与p53基因突变的联系研究罕有报道。本研究采取胃癌、癌旁组织和正常组织，应用免疫组化及RT-PCR的方法检测FAT10及p53在人胃癌组织中的表达，试图探讨FAT10在人胃癌发生、发展及转移中的作用，以及突变p53基因在肿瘤中对其的促进作用。为肿瘤预防、早期诊断提供理论依据，并为基因治疗提供目标。临床资料与方法一、标本收集1．病例资料：研究对象为胃癌患者共计62例，其中男性38例，女性24例，年龄21～86岁，平均59．62岁，所有标本均经病理证实。胃癌有淋巴结转移39例，无淋巴结转移23例；有远处转移15例，无远处转移47例；共62例。2．收集方法：癌旁组织取距肿瘤旁2cm胃组织，正常胃组织取距肿瘤5cm以外胃组织。每个组织均为离体后半小时内取材，剔除坏死出血组织，编号标记并记录临床资料，将用于免疫组化的癌组织、癌旁组织及正常胃组织置于10％的甲醛液中保存，另一份癌组织、癌旁组织及正常胃组织立即置于液氮罐中并转入-80℃冰箱保存用于RT-PCR检测。3．胃癌TNM分期按1997年国际抗癌联盟（UICC）公布的PTNM分期。二、主要实验试剂及溶液配制1．兔抗人FAT10多克隆抗体购自上海吉泰生物科技有限公司。2．兔抗人p53单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。3．生物素标记的FAT10二抗与p53鼠抗兔二抗分别购自上海吉泰与武汉博士德。4．免疫组化染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司5．DAB显色试剂盒、粘片剂APES购自福州迈新生物技术开发有限公司。6．RNA快速抽提纯化（Trizol）试剂盒购自Gibco BRL公司。7．Oligo dT及MMLV购自Promega公司8．引物制备：上海生工生物工程有限公司合成，经Genebank检索为特异性引物：内参照β-actin引物序列为：上游引物：5′-TCA CCC ACA CCG TGC CCA TCT ACG A-3′下游引物：5′-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ACG G-3′FAT10特异性引物序列为：上游引物：5′-AAT GCT TCC TGC CTC TGT GT-3′下游引物：5′-GCC GTA ATC TGC CAT CAT CT-3′突变的p53特异性引物序列为：上游引物：5’—CCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAA—3’下游引物：5’—ACAGCATCAAATCATCCATTGC—3’三、主要仪器和设备产品名称生产或经销公司国籍石蜡包埋机Leica公司德国病理石蜡切片机Leica公司德国万能显微镜成像系统（Leica DMR） Leica公司德国光学显微镜照相系统Olympus日本GeneAmp 2400 PCR System：Perkin Elmer公司美国SCR-300A稳流稳压电泳仪上海康华生化仪器制造厂中国电泳槽上海康华生化仪器制造厂中国数码凝胶成像系统BIO-RAD GDEQ杭州宝诚生物技术有限公司中国紫外分析仪Beckman DU640 Beckman公司美国ZF-1紫外分析仪上海康华生化仪器制造厂中国DL-8R冷冻离心机上海市离心机械研究所中国XW-80A旋涡混合器上海医科大学仪器厂中国震荡器XW-80A上海医科大学仪器厂中国低温冰箱Forma Scientific Inc美国四、检测指标及方法1．FAT10、p53蛋白免疫组化（二步法）测定：免疫组化主要操作步骤如下：1)10％的福尔马林固定的癌组织、癌旁组织及正常胃组织，石蜡包埋，切片。2)切片常规脱蜡。3)过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。4)抗原修复。5)滴加正常兔血清封闭液。6)滴加兔抗人FAT10多克隆抗体及一抗为兔抗人p53单克隆抗体工作液，以PBS溶液代替一抗作为阴性对照片。7)加50ul生物素标记的FAT10二抗及生物素化p53鼠抗兔二抗。8)DAB显色。9)苏木素复染。10)梯度酒精脱水。11)光学显微镜下观察判定免疫组化结果。2．FAT10、p53-mRNA RT-PCR测定：1)RNA提取及分析：（1）RNA提取：采用TRIZOL试剂一步提取法。（2）RNA分析：①普通琼脂糖凝胶电泳分析。②分光光度仪分析。2)逆转录cDNA的合成及电泳验证逆转录产物cDNA。cDNA模板进行PCR或保存于-20℃冰箱备用．3)PCR扩增反应：PCR扩增体系：cDNA样品2μl内参上游引物0．5μl内参下游引物0．5μl10×Buffer 2．5μlMgCl2 2μlTaq酶0．15μl2mMdNTPs 2μlddH2O 15．35μl总体积25μl（1）内参照β-actin基因PCR扩增反应条件：PCR扩增产物为295bp。（2）FAT10基因的PCR扩增反应条件：PCR扩增产物为478bp。（3）突变p53基因的PCR扩增反应条件：PCR扩增产物为：492bp。4)产物电泳分析。五、统计学处理1．免疫组化实验所得定性数据采用x2检验或分类资料的关联性检验判定两者关系。用Spearman秩相关分析两者之间的关系。FAT10与肿瘤临床病理特征的关系用阳性／阴性计数进行定性数据的x2检验进行统计。生存率制作Kaplan-Meier生存曲线，进行Log-rank生存曲线检验。对本组病例治疗后影响预后的因素进行Cox模型多因素分析。2．RT-PCR条带灰度值结果用均数±标准差（（?）±s）表示，样本间均数的比较采用t检验，用Pearson相关分析分析突变p53与FAT10表达的相关性。3．所有数据采用SPSS12．0统计软件包处理，P<0．05表示差异有显著性；P<0.01表示差异非常显著。结果一、免疫组织化学检测FAT10及p53蛋白在胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织中的表达1．FAT10免疫组织化学染色：FAT10的表达主要定位于细胞核，阳性物质呈颗粒状。FAT10在胃癌组织中的阳性表达率显著高于相应的癌旁组织及正常胃组织，其阳性率分别为51．61％、12．90％及6．45％，差异均有非常显著性（P<0．01），而癌旁组织与正常胃组织比较，FAT10的阳性表达率差异无显著性（P>0．05）。2．p53免疫组织化学染色：p53的表达主要定位于胞核，阳性物质呈颗粒状，可弥散到胞浆中。p53在胃癌组织中的表达显著高于相应的癌旁组织及正常胃组织，其阳性率分别为45．16％、14．51％及9．68％，差异均有非常显著性（P<0．01），而癌旁组织与正常胃组织比较，p53的阳性表达率差异无显著性（P>0．05）。3．FAT10蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系：胃癌组织中FAT10的表达主要与胃癌的淋巴转移与否及TNM分期（Ⅲ+Ⅳ/Ⅰ+Ⅱ）密切相关（P均<0．05）。而与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、发生部位、进展程度、分化程度及远处转移无显著相关性（P均>0．05）。39例淋巴转移患者胃癌组织FAT10阳性表达者转移淋巴也呈FAT10阳性表达。4．FAT10与p53蛋白在胃癌组织中表达的相关性分析：p53阳性胃癌中FAT10表达率为82．14％（23／28），而p53阴性胃癌FAT10表达率仅26．47（9／34），用双向无序分类资料的关联性检验说明FAT10与p53表达存在一定的相关性。Spearman秩相关分析得出胃癌组FAT10蛋白表达和突变型p53蛋白表达存在显著正相关性。二、RT-PCR检测FAT10及突变p53-mRNA在胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织中的表达1．胃癌组织、癌旁组织以及正常胃组织中FAT10-mRNA表达：胃癌组织、癌旁组织及正常胃组织中FAT10-mRNA条带灰度值分别为0．689±0．023、0．463±0．019及0．451±0．028，采用配对t检验，发现胃癌组织FAT10-mRNA条带灰度值显著高于相应的癌旁组织及正常胃组织（t值分别为3．12及4．64，P均<0．01），癌旁组织与正常胃组织两者比较无显著性差异（t值为1．03，P>0．05）。2．胃癌组织、癌旁组织以及正常胃组织中突变p53-mRNA表达：胃癌组织、癌旁组织以及正常胃组织中突变p53-mRNA条带灰度值分别为0．471±0．021、0．398±0．017及0．421±0．019，采用配对t检验，发现胃癌组织突变p53-mRNA条带灰度值显著高于相应的癌旁组织及正常胃组织（t值分别为6．79及5．51，P均<0．01），癌旁组织与正常胃组织两者比较无显著性差异（t值为1．22，P>0．05）。3．FAT10-mRNA的表达与胃癌临床病理特征的关系：胃癌组织中FAT10-mRNA的表达主要与胃癌的淋巴转移与否及TNM分期（Ⅲ+Ⅳ／Ⅰ+Ⅱ）密切相关（P均<0．05）。而与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、发生部位、进展程度、分化程度及远处转移无显著相关性（P均>0．05）。FAT10-mRNA的表达与胃癌临床病理特征的关系结果与免疫组织化学基本一致。4．FAT10与p53基因在胃癌组织中表达的相关性分析：Spearman等级相关分析，胃癌组中FAT10基因表达和突变型p53基因表达存在正相关性。用Pearson相关分析其相关性，说明FAT10与p53基因呈显著正相关。三、胃癌FAT10蛋白及FAT10-mRNA的表达与生存率的关系：除4例患者失访外，其余病例均获随访，随访时间48～72个月。对本组患者术后累积生存率进行单因素分析，均经Log-rank生存曲线检验。根据Log-rank生存曲线检验，FAT10蛋白表达阳性胃癌患者生存时间显著低于表达阴性者，P<0．05。根据Log-rank生存曲线检验，FAT10-mRNA的表达阳性胃癌患者生存时间显著低于表达阴性者，P<0．05。经Cox模型多因素分析，结果显示FAT10蛋白及mRNA的表达与肿瘤淋巴结转移、远处转移、临床TNM分期、p53蛋白及p53 mRNA同为影响胃癌预后的独立因素。结论1．胃癌组织FAT10蛋白表达及FAT10-mRNA相对表达量显著高于相应的癌旁组织及正常胃组织。胃癌组织中FAT10蛋白及mRNA的表达主要与胃癌的淋巴转移与否及TNM分期密切相关。而与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小、发生部位、进展程度、分化程度及远处转移无显著相关性。FAT10-mRNA的表达与胃癌临床病理特征的关系结果与免疫组织化学基本一致。2．胃癌组织中p53蛋白表达及p53-mRNA相对表达量明显高于相应的癌旁组织及正常胃组织，而癌旁组织与正常胃组织两者比较无显著性差异。3．胃癌组织中FAT10基因的表达与突变p53基因的表达均增强，蛋白水平与基因水平检测的结果一致。两者增高在统计学上均有统计学意义，并呈现明显的正相关。4．FAT10蛋白及FAT10-mRNA的表达阳性胃癌患者生存时间均显著低于表达阴性者。经Cox模型多因素分析，结果显示FAT10蛋白及mRNA的表达与肿瘤淋巴结转移、远处转移、临床TNM分期、p53蛋白及p53 mRNA同为影响胃癌预后的独立因素。