肌动蛋白抑制杆状病毒多角体蛋白基因的转录与表达

论文摘要

肌动蛋白是真核细胞骨架的主要成分,与细胞内的许多重要功能活动有关。近年来的研究表明,一些病毒在其感染过程中,与细胞内的肌动蛋白相互作用。这是病毒和宿主之间复杂的相互作用的重要体现,同时也说明肌动蛋白在病毒的感染过程中具有重要的作用。杆状病毒是一类大型环状双链DNA病毒,作为一种高效的生物杀虫剂、真核表达系统以及基因治疗载体的研究和应用,其分子生物学和侵染机制的研究也取得了很大进展。杆状病毒基础理论的研究不仅有助于对病毒自身的了解,而且为更好的利用杆状病毒提供了契机。像许多病毒一样,杆状病毒在昆虫细胞内复制过程中,也与肌动蛋白发生一系列的相互作用,如核衣壳的向核运输,基因组的表达和复制,子代核衣壳的装配,晚期多角体的形成等。本文首先对重组病毒AcMNPV-GFP-actin（ph-）进行分析。实验发现表达的外源肌动蛋白并不影响病毒对Sf9细胞的感染性,但在感染晚期,受染细胞内肌动蛋白的分布出现明显变化,先从细胞质转运到核内,然后又从核内转运出来。为进一步研究肌动蛋白在杆状病毒感染晚期的作用,我们利用Bac-to-Bac系统构建了表达多角体基因、肌动蛋白与绿色荧光蛋白融合基因的重组病毒vAc-ph/70GA和vAc-ph/PGA,同时构建对照病毒vAc-ph。重组病毒vAc-ph/70GA感染Sf9细胞后能持续表达肌动蛋白,但不能形成多角体;vAc-ph则能形成多角体,说明所克隆的多角体基因是能够正常表达的。SDS-PAGE显示vAc-ph/70GA感染晚期,细胞内没有多角体蛋白的表达;而RT-PCR的结果进一步表明多角体基因的转录被抑制。肌动蛋白的表达并没有影响vAc-ph/70GA对细胞的感染力。本研究的结果表明,晚期持续表达的外源肌动蛋白抑制了多角体基因的转录和表达,从而导致多角体不能正常产生。 论文共分三部分:第一部分前言对杆状病毒作了概括性介绍,包括杆状病毒的分类命名、结构、复制周期、基因组复制和表达及其调控、杆状病毒的应用等,并重点介绍了本实验的研究背景,即杆状病毒与细胞肌动蛋白的相互作用和研究目的;第二部分介绍了本实验中应用的所有材料与方法;第三部分介绍了本实验研究的结果,以及我们对结果的讨论。

论文目录

• 前言
• 1 杆状病毒简介
• 1.1 杆状病毒的分类和命名
• 1.2 杆状病毒的结构
• 1.3 杆状病毒的感染周期
• 1.4 杆状病毒基因组特征
• 1.5 杆状病毒的结构蛋白基因
• 1.6 杆状病毒基因的时序性表达与相关基因
• 1.7 杆状病毒 DNA复制与相关基因
• 1.8 杆状病毒与宿主相互作用的基因
• 1.9 杆状病毒的应用
• 2 本实验的研究背景及目的
• 2.1 本实验的研究背景一杆状病毒与肌动蛋白的相互作用
• 2.2 本试验的目的和意义
• 材料和方法
• 1 材料
• 1.1 大肠杆菌菌株
• 1.2 昆虫细胞系
• 1.3 病毒和 Bacmid
• 1.4 质粒
• 1.5 引物
• 1.6 培养基
• 1.7 酶、化学试剂和试剂盒
• 1.8 抗生素
• 2 方法
• 2.1 大肠杆菌中质粒 DNA的提取方法
• 2.2 大肠杆菌中Bacmid的提取法
• 2.3 DNA限制性酶切片段和 PCR产物的回收
• 2.4 PCR（聚合酶链反应）
• 2.5 电转化用感受态细胞的制备和电转化
• 2.6 SDS-PAGE
• 2.7 杆状病毒对昆虫细胞的感染和扩增
• 2.8 重组bacmid DNA转染 Sf9细胞
• 2.9 重组病毒的构建
• 2.10 终点稀释法测定病毒滴度
• 2.11 重组病毒生长特性比较
• 2.12 重组病毒感染 Sf9细胞的切片制备和电子显微镜观察
• 2.13 转录分析（RT-PCR）
• -）感染的 Sf9细胞中肌动蛋白的亚细胞定位'>2.14 AcMNPV-GFP-actin（Ph^-）感染的 Sf9细胞中肌动蛋白的亚细胞定位
• 2.15 Hoechst33258核染色以及激光共聚焦显微镜观察
• 2.16 CD处理
• 结果和讨论
• -）的分析'>1 对重组病毒 AcMNPV-GFP-actin（ph^-）的分析
• -）感染 Sf9细胞中肌动蛋白基因的转录分析'>1.1 AcMNPV-GFP-actin（ph^-）感染 Sf9细胞中肌动蛋白基因的转录分析
• -）与 AcMNPV生长特性的比较'>1.2 AcMNPV-GFP-actin（ph^-）与 AcMNPV生长特性的比较
• -）感染的 Sf9细胞中肌动蛋白的亚细胞定位'>1.3 AcMNPV-GFP-actin（ph^-）感染的 Sf9细胞中肌动蛋白的亚细胞定位
• -）感染的Sf9细胞中肌动蛋白亚细胞定位的影响'>1.4 CD对AcMNPV-GFP-actin（ph^-）感染的Sf9细胞中肌动蛋白亚细胞定位的影响
• -）感染 Sf9细胞的切片观察'>1.5 AcMNPV-GFP-actin（ph^-）感染 Sf9细胞的切片观察
• 2 重组病毒的构建、鉴定和分析
• 2.1 多角体基因的克隆和测序
• 2.2 转移载体的构建
• 2.3 重组 Bacmid的构建
• 2.4 重组病毒的获得和 PCR鉴定
• 2.5 感染实验
• 2.6 重组病毒vAc-ph/70GA感染 Sf9细胞的超微结构分析
• 2.7 重组病毒vAc-ph和vAc-ph/70GA多角体基因表达的分析
• 2.8 重组病毒vAc-ph/70GA的生长特性
• 3 讨论
• 参考文献
• 已发表和撰写的文章
• 致谢