降纤酶制备工艺及质量标准的研究

论文摘要

以中国长白山白眉蝮蛇蛇毒为原料,根据蛇毒的生物学特征,采用不同方法对蛇毒的真伪进行鉴别,并对降纤酶分离纯化的生产工艺以及质量标准进行了研究。采用三种不同介质sourse 15Q,sourse 15S,sourse 30S进行离子交换色谱分离,能有效除去杂蛋白,保留活性组分。其中Sourse 30具有低压系统分辨率很高、成本低的特点。用Heparin-sepharoseCL-4B,Heparin-sepharoseCL-6B,Heparin-sepharose 6 Fast Flow三种亲和介质分离,得到的色谱图谱基本一致,为一个峰,对降纤酶的分离能力无差别,考虑到生产中的成本,选用价格比较低的Heparin-SepharoseCL-6B。将得到降纤酶粗品,采用Sourse 15PHE,Sourse 15ETH,Sourse 15ISO三种介质进行疏水分离,各得到两个峰。活性检测表明,第二个峰为活性峰,Sourse 15PHE活性组分的活性比另外两种介质得到的活性组分高。在此基础上采用凝胶介质Superdex 200,Superdex 30,Superdex 75分离,得到分离峰相似,都是一个具有活性的洗脱峰。其中Superdex 75具有低非特异性吸附,提高回收率,分辨率、选择性高。经过介质筛选和工艺参数的小试研究,对工艺生产进行放大。最终经过离子交换,亲和色谱,经过滤除菌,疏水色谱分离,再超滤,凝胶色谱分离。得到的活性峰,经高效液相色谱分析,其纯度达99.0%以上,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为一条单成份带,分子量为36500。该分离纯化方法经过实际生产应用,具有工艺过程简单,在生产过程中除去了神经毒、出血毒及其它有害毒素,与国内同类产品比较,具有降纤酶纯度高,副作用小,产品质量稳定等优点。参照2000年中国药典,对降纤酶理化性质进行分析与检测,并进行稳定性考察。经观察和检测,在36个月内稳定,本品的有效期定为2年。为此,建立本产品的质量控制指标。与目前临床使用的t-PA,尿激酶,链激酶等溶栓制剂相比,蛇毒纤溶酶有其优点,可望成为临床联合应用溶栓制剂或作为替代溶栓药物。

论文目录

• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛇毒毒素
• 1.1.1 蛇毒毒素的种类及活性因子
• 1.1.2 蛇毒的利用和发展
• 1.2 降纤酶
• 1.2.1 降纤酶的作用机理
• 1.2.2 降纤酶的临床应用与研究
• 1.2.3 降纤酶与其它溶栓药物比较
• 1.2.4 市场需求
• 1.3 生物大分子的纯化分离
• 1.3.1 生物大分子的分离基质
• 1.3.1.1 硅胶类基质
• 1.3.1.2 多糖类凝胶基质
• 1.3.1.3 灌流色谱基质
• 1.3.1.4 聚丙烯酰胺凝胶
• 1.3.1.5 纤维素类介质
• 1.3.2 生物大分子纯化分离模式
• 1.3.2.1 体积排阻层析
• 1.3.2.2 离子交换层析
• 1.3.2.3 疏水作用层析
• 1.3.2.4 亲和层析
• 1.4 本文的研究内容与意义
• 第二章 降纤酶制备工艺研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料及来源
• 2.1.2 仪器与试剂
• 2.1.2.1 主要仪器与设备
• 2.1.2.2 药品与试剂
• 2.1.3 蝮蛇毒的鉴别
• 2.1.3.1 真伪鉴别
• 2.1.3.2 生化特性的鉴别
• 2.1.4 系统适应性试验
• 2.1.5 PAGE 电泳
• 2.1.6 小试不同色谱介质的分离
• 2.1.6.1 离子交换色谱
• 2.1.6.2 亲和色谱
• 2.1.6.3 疏水色谱
• 2.1.6.4 凝胶色谱
• 2.1.7 中试放大后的分离
• 2.1.7.1 降纤酶的分离纯化工艺研究
• 2.1.7.2 溶解与离心
• 2.1.7.3 离子交换色谱
• 2.1.7.4 亲和色谱
• 2.1.7.5 过滤
• 2.1.7.6 疏水色谱
• 2.1.7.7 超滤
• 2.1.7.8 凝胶色谱
• 2.1.8 纯度检测
• 2.1.8.1 SDS-PAGE 电泳法检查
• 2.1.8.2 HPLC 法检测
• 2.1.9 出血毒与神经毒测定
• 2.1.10 蛋白含量测定
• 2.1.11 比活力测定
• 2.1.12 PH 对酶活性的影响
• 2.1.13 等电点测定
• 2.1.14 降纤酶中细菌内毒素去除的控制
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 蝮蛇毒的鉴别方法
• 2.2.1.1 真伪鉴别结果
• 2.2.1.2 不同蝮蛇毒性质鉴别结果
• 2.3 小试不同色谱介质对分离影响
• 2.3.1 离子交换色谱
• 2.3.2 亲和色谱
• 2.3.3 疏水色谱
• 2.3.4 凝胶色谱
• 2.3.5 小试小结
• 2.4 降纤酶生产放大制备工艺
• 2.4.1 离子交换 Sourse 30S 柱色谱
• 2.4.2 Heparin—sepharoseCL—6B 亲和色谱
• 2.4.3 Sourse 15 疏水色谱
• 2.4.4 superdex75 凝胶色谱
• 2.4.5 生产放大小结
• 2.5 降纤酶生产中细菌内毒素的去除
• 2.5.1 缓冲溶液的细菌内毒素去除结果
• 2.5.2 降纤酶细菌内毒素的工艺去除结果
• 2.6 PH 对酶活性的影响
• 2.7 等电点测定
• 2.8 放大工艺产品质量
• 第三章 注射用降纤酶的质量标准研究
• 3.1 理化性状
• 3.1.1 鉴别
• 3.1.2 酸度检查
• 3.1.3 溶液的澄清度与颜色
• 3.1.4 干燥失重
• 3.1.5 无菌检查
• 3.1.6 细菌内毒素
• 3.1.7 过敏试验
• 3.1.8 异常毒性
• 3.1.9 出血毒
• 3.1.10 效价测定
• 3.1.10.1 标准品溶液的制备
• 3.1.10.2 供试品溶液的制备
• 3.1.10.3 测定法
• 3.2 蛋白含量的测定
• 3.2.1 对照品溶液的配制
• 3.2.2 供试品溶液的配制
• 3.2.3 标准曲线的制备
• 3.2.4 供试品的测定
• 3.3 降纤酶体外溶解纤维蛋白试验
• 3.3.1 纤维蛋白平板的制备
• 3.3.1.1 试剂配制
• 3.3.1.2 制备纤维蛋白平板
• 3.3.1.3 测定方法与结果
• 3.3.2 小结
• 3.4 降纤酶活力测定（BAEE 法）
• 3.4.1 供试品溶液的制备
• 3.4.2 底物溶液的制备
• 3.4.3 测定法
• 3.4.4 测定结果
• 3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测降纤酶分子量及纯度
• 3.5.1 试剂
• 3.5.2 操作法
• 3.5.2.1 凝胶的制备
• 3.5.2.2 标准品和供试品的制备
• 3.5.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质
• 3.5.3 测试结果
• 3.6 过敏试验法
• 3.7 辅纯通栓酶半数致死量（LD50）测定
• 3.7.1 动物称重分组一—均衡随机二步法
• 3.7.2 低比系列稀释法配制药液
• 3.7.3 间接跳组给药
• 3.7.4 试验结果
• 3.8 注射用降纤酶的稳定性试验
• 第四章 总结
• 参考文献
• 附Ⅰ 试剂配制
• 附Ⅱ 四种介质
• 附Ⅲ 注射用降纤酶的稳定性试验一
• 附Ⅳ 注射用降纤酶的稳定性试验二
• 附Ⅴ 注射用降纤酶检验报告
• 发表论文情况说明
• 致 谢