芳香烃受体核易位蛋白ARNT2对肝癌增殖的影响及其机制研究

论文摘要

原发性肝细胞癌（肝癌）是我国常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均位列恶性肿瘤第二位。肝癌的高侵袭、易复发和高转移特征已成为制约患者长期生存改善的瓶颈。探索肝癌转移机制、寻找新的干预手段是从事肝癌临床和基础研究工作者不得不面临和克服的一大挑战。前期的研究结果发现,芳香烃受体核易位蛋白ARNT可以抑制肝癌增殖,而与ARNT具有高度同源序列的ARNT2在肝癌中的作用报道甚少。本研究首先观察ARNT2在肝癌和癌旁组织中的表达与肝癌患者术后预后的关系；然后探讨ARNT2表达改变对肝癌生长的影响；最后进一步明确ARNT2调控肝癌增殖的分子机制。第一部分芳香烃受体核易蛋白ARNT2在在肝癌组织中的表达及其与预后的关系目的：比较ARNT2在肝癌及相应癌旁组织中的表达差异,分析ARNT2在原发性肝癌中的表达与原发性肝癌预后的关系。方法：应用组织微阵列技术和免疫组织化学染色方法,回顾性研究195例行手术切除并经病理学证实的肝细胞癌标本（癌和癌旁组织）中ARNT2的表达情况,Log-rank法比较肝癌中不同ARNT2表达组间生存率和复发率的差别,COX回归模型进行单因素、多因素分析各有关因素对患者生存率和复发率的影响。结果：免疫组化显示ARNT2主要表达在胞质,肝癌和癌旁的表达量分别为0.298±0.01939,0.080±0.00796,两者间的差异明显（p<0.001）。肿瘤ARNT2的表达与患者年龄（p=0.019）,肿瘤大小（p=0.003）,肿瘤的分化（p=0.002）,TNM分期（p=0.001）,门脉癌栓（p=0.02）以及AFP的表达（p<0.001）均相关。同时,ARNT2的表达与患者的生存和复发显著相关,高表达组患者的总体生存率显著高于低表达组,复发率显著低于低表达组（分别p<0.001和p=0.004）COX回归模型单因素分析发现肿瘤大小、TNM分期、癌栓和癌内ARNT2表达是影响肝癌患者总体生存的相关因素,而且肿瘤大小、TNM分期、癌栓、AFP的水平和癌内ARNT2表达与肿瘤复发相关；多因素分析则发现癌内ARNT2表达是影响肝癌患者预后的独立保护因素。结论：ARNT2在肝癌的预后中发挥了重要的作用,癌内ARNT2高表达是影响肝癌预后的保护性因素。第二部分芳香烃受体核易位蛋白ARNT2表达改变对肝癌增殖以及侵袭能力的影响目的：明确ARNT2表达对实验性肝癌增殖以及侵袭能力影响。方法：构建靶向Arnt2的干扰性和过表达慢病毒载体pLentiARNT2i、pLenti ARNT2ox,转染HCCLM6细胞,筛选出GFP稳定表达的细胞株,经RT-PCR和Western Blotting验证ARNT2表达改变后,分别用CCK-8法检测细胞增殖、Boyden小室检测细胞的迁移和侵袭能力变化。同时将转染后的细胞接种于裸鼠体内,研究ARNT2表达改变后,裸鼠体内肝癌生长速度的改变。结果：靶向Arnt2的重组慢病毒载体pLentiARNT2i和pLenti ARNT2ox转染HCCLM6细胞,筛选出两株ARNT2表达改变明显的稳定细胞株LentiARNT2i和LentiARNT2ox; CCK-8法检测结果显示LentiARNT2i细胞增殖最快,LentiARNT2ox增殖最慢；LentiARNT2i侵袭和运动能力明显增强,LentiARNT2ox细胞侵袭和运动能力较对照组明显减弱；体内实验结果显示ARNT2低表达组肿瘤生长加快,ARNT2高表达组肿瘤生长明显减缓。结论：ARNT2与肝癌的生长增殖呈负相关,具有抑制肝癌生长与增殖的作用。第三部分ARNT2抑制肝癌增殖的机制研究目的：探讨ARNT2抑制肝癌增殖的分子机制。方法：用Illumina’s Solexa测序法检测ARNT2表达改变后,基因转录组的变化。结果：Solexa测序发现BRAF、ARAF、CRAF、KRAS、NRAS、SMEK1、SMEK2、CERK、CERKL、SMEK3P等基因在Mock,LentiARNT2i以及LentiARNT2ox三组中差异表达。结论：ARNT2可能部分通过RAS-RAF-MEK-ERK信号通路来调节肝癌细胞的增殖。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 芳香烃受体核易蛋白ARNT2在肝癌组织中的表达及其与预后的关系
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 芳香烃受体核易位蛋白ARNT2表达改变对肝癌增殖以及侵袭能力的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 芳香烃受体核易位蛋白ARNT2抑制肝癌增殖的机制研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述 bHLH-PAS家族在肿瘤进展中的作用
• 附
• 中英文名词对照
• 致谢