灰葡萄孢角质酶的致病作用及角质酶突变菌株的基因分析

论文摘要

灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）是重要的植物病原真菌,其产生的降解酶类是主要的致病因子。角质酶是病菌产生的能够降解植物体表角质层的水解酶。明确角质酶的致病作用,能够为进一步解析病菌致病机理提供依据。用紫外线诱变灰葡萄孢H2菌株,得到两株产角质酶能力增强的突变菌株H2-M1、H2-M2,其菌丝分泌的酶活性分别达34.68U/mL,33.51U/mL,分别为出发菌株的2.05倍和1.98倍；两株产酶能力降低的菌株H2-M3,H2-M4,酶活性为3.80U/mL,3.98U/mL,分别占出发菌株的22.5%与23.5%。出发菌株菌丝产生的角质酶活性为16.92U/mL。病菌萌发过程中芽管也能分泌角质酶,与菌丝相比酶活性较低。H2-M1、H2-M2、H2-M3和H2-M4分生孢子萌发时的角质酶活性分别为0.20U/mL、0.18U/mL、0.01U/mL和0.01U/mL,出发菌株酶活性为0.10U/mL对突变菌株致病因子检测结果表明,4株突变菌株除产角质酶的性状发生了变异外,其它致病因子（果胶酶、纤维素酶、毒素）的代谢与出发菌株均没有显著差异。利用上述5个菌株的分生孢子悬浮液对番茄叶片喷雾接种,菌饼对果实接种,检测其致病性。结果表明,产酶能力强的两个突变菌株H2-M1、H2-M2,其致病力明显高于出发菌株,而酶活性低的H2-M3、H2-M4则显著低于出发菌株。对草莓果实和叶片的致病力检测结果与对番茄的检测结果一致,产生角质酶较少的突变株,其致病力显著低于出发菌株。从以上试验内容可以看出,灰葡萄孢角质酶在病菌侵入过程中能起促进病菌侵入、增加病菌毒力的作用。通过PCR技术,克隆获得突变菌株的角质酶基因,与出发菌株比较,虽然有少数碱基的差异,但是突变位点不在酶活性中心部位,也不在与底物结合部位；内含子中也有少数位点碱基发生变化,但编码的蛋白质与出发菌株一样。因此突变菌株的角质酶基因与出发菌株相比基本一致。实时荧光定量PCR （Real-time qPCR）研究表明,角质酶基因在突变菌株中都能表达,但是H2-M1和H2-M2表达量高于出发菌株2倍以上,而H2-M3和H2-M4的表达量显著低于出发菌株,分别只有出发菌株的21%和19%。因此突变菌株的角质酶基因并未发生变异,产酶性状的变异可能是由基因转录改变造成的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一、真菌角质酶研究
• （一） 角质酶性质
• （二） 角质酶催化机理
• （三） 角质酶基因研究
• （四） 角质酶在病菌致病过程中的作用
• （五） 角质酶应用
• 二、灰葡萄孢及其角质酶
• （一） 灰葡萄孢病害及其危害性
• （二） 灰葡萄孢生物学特征
• （三） 灰葡萄孢的致病性
• （四） 灰葡萄孢角质酶的研究
• 三、本论文研究目的与意义
• 材料与方法
• 一、供试植株
• 二、试验菌株
• 三、培养基及培养液
• （一） 真菌培养基
• （二） 改良的查彼克——多克斯矿质培养基
• （三） 灰葡萄孢产酶培养液及产毒素培养液
• （四） LB培养基
• 四、试剂和仪器
• （一） 主要试剂
• （二） 主要仪器
• 五、角质酶突变体诱变与筛选
• （一） 诱变方法
• （二） 筛选方法
• 六、突变体致病因子测定
• （一） 角质酶测定
• （二） 胞壁降解酶测定
• （三） 毒素测定
• 七、灰葡萄孢基因组DNA提取
• （一） DNA提取
• （二） DNA纯度和浓度测定
• 八、角质酶基因克隆
• （一） 引物设计
• （二） PCR扩增
• （三） PCR产物纯化
• （四） 重组质粒构建
• （五） 重组质粒DNA提取
• 九、灰葡萄孢角质酶基因的表达
• （一） 灰葡萄孢RNA的提取
• （二） 反转录
• （三） 实时荧光定量PCR检测
• 十、病菌致病力测定方法
• （一） 接种方法
• （二） 严重度分级标准
• 结果与分析
• 一、角质酶突变菌株筛选
• 二、突变菌株角质酶活性
• （一） 分生孢子产生的角质酶
• （二） 菌丝产生的角质酶
• （三） 产酶性状的稳定性
• 三、突变菌株生物学特性
• （一） 菌丝生长及菌落特征
• （二） 胞壁降解酶与毒素活性
• 四、突变菌株的致病作用
• 五、角质酶基因克隆和序列分析
• （一） 基因组DNA提取
• （二） 角质酶基因克隆
• （三） 角质酶基因序列比对
• 六、突变菌株角质酶基因的表达量
• （一） 灰葡萄孢RNA提取
• （二） 实时荧光定量PCR检测
• 讨论
• 一、角质酶的致病作用
• 二、角质酶基因
• 三、实时荧光定量PCR
• 参考文献
• 附录
• 致谢