JWA通过线粒体凋亡通路影响肿瘤细胞耐药性

论文摘要

在肿瘤治疗中,化疗占据了相当重要的位置,但肿瘤细胞的耐药大大降低了化疗药物的疗效,导致化疗失败,肿瘤复发。目前有关耐药机制还不完全清楚,主要与以下几个方面有关:（1）药物外排作用相关蛋白表达增强,其中P-糖蛋白最为经典;（2）在细胞凋亡途径中任何一个环节的异常都将影响化疗药物的效果;（3）抗肿瘤药物能够引起MAPK信号转导系统的激活及肿瘤多药耐药性（MDR）的产生;（4）其它,如肿瘤细胞损伤后自我修复能力增强,肿瘤细胞解毒系统增强,肿瘤新生血管的形成等。最近的研究表明细胞凋亡和抗凋亡的关键途径的异常是肿瘤耐药发生和发展的关键因素之一,使得肿瘤耐药和细胞凋亡的研究更加引人注目。近几年来,随着分子机制研究的深入,基因技术已应用于多种肿瘤的研究中,应用基因治疗来逆转肿瘤的多药耐药性已成为一种可能。JWA基因编码一种新的微管相关蛋白（microtubule-associated protein,MAP）,该蛋白不仅参与多条分化和/或凋亡所涉及的信号通路,参与细胞对刺激的应答,同时也参与细胞凋亡的调节。基于细胞凋亡与肿瘤多药耐药性的密切关系,我们推测JWA可能通过调节肿瘤细胞的凋亡过程,从而影响其多药耐药性的产生。本研究采用细胞分子生物学实验技术,以人绒毛膜癌JAR细胞及其耐药细胞JAR/VP16为模型,探讨JWA参与细胞耐药可能的机制,为其逆转肿瘤的耐药性提供实验依据。另外,还初步阐明了JWA参与耐药的信号转导通路,为进一步阐明JWA基因的结构、功能及其相互关系奠定基础。一、JWA是VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡的必需分子用Hoechst 33258染色和Annexin V-PE流式细胞术两种方法测定VP16诱导JAR、JAR/VP16细胞凋亡,结果发现细胞凋亡率随VP16浓度的增加而增加,JAR细胞凋亡率明显高于JAR/VP16细胞。同时应用Western Blot检测JWA蛋白表达,发现JWA蛋白在JAR细胞中的表达明显高于在JAR/VP16细胞中的表达。提示JWA可能与细胞凋亡有关。为了探讨JWA是否为VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡的必需分子,我们成功构建了JWA低表达细胞株（siJWA-JAR）,采用Annexin V-PE流式细胞术检测1×10-3 g/L VP16处理JWA低表达细胞株48 h后的凋亡率,结果发现与空转组相比,凋亡率明显下降。提示JWA确实参于VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡过程。二、JWA通过线粒体通路调节VP16诱导的细胞凋亡为进一步探讨JWA调节VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡的机制,我们首先需要了解JWA的作用与哪条凋亡通路有关。通过检测VP16处理对照细胞C1-JAR和siJWA-JAR中特异性天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶Caspase-8,Caspase-9的差异,发现Caspase-9在siJWA-JAR中剪切片段显著减少,而Caspase-8无显著变化,说明JWA在VP16诱导JAR和JAR/VP16细胞凋亡中主要通过Caspase-9通路（即线粒体通路）而非死亡受体通路。进而应用罗丹明123标记,流式细胞仪检测VP16处理C1-JAR和siJWA-JAR后线粒体膜电位变化的差异。在siJWA-JAR中,VP16诱导的线粒体膜电位损伤被明显抑制,从而进一步证明JWA是通过线粒体通路影响VP16诱导细胞凋亡的。三、JWA对VP16诱导细胞凋亡信号分子的影响用1×10-3 g/L VP16处理JAR、JAR/VP16、C1-JAR和siJWA-JAR 48 h,采用Western Blot检测MAPK信号分子的变化。结果发现,JAR/VP16和siJWA-JAR细胞中P38、JNK的磷酸化几乎被完全抑制;而它们的本底水平（非磷酸化分子）无明显变化,表明JWA与P38及JNK细胞凋亡信号分子有关。四、JWA通过JNK通路调节P-糖蛋白（P-gp）的表达为了深入探讨JWA是否通过JNK通路调节P-糖蛋白的表达。用1×10-3 g/L VP16处理JAR、JAR/VP16、C1-JAR和siJWA-JAR 48 h,采用Western Blot检测p-JNK、p-c-Jun和P-gp蛋白的表达情况,结果发现,JAR/VP16和siJWA-JAR细胞中,JNK和c-Jun的磷酸化几乎被完全抑制;而P-gp表达增加。为了进一步确定JNK能否调节P-gp的表达,我们采用20 nM SP600125作用于JAR和JAR/VP16细胞48 h后,SP600125抑制了p-JNK、p-c-Jun的表达,而P-gp表达增加。说明JWA确实通过JNK通路调节P-糖蛋白的表达。综上所述,本研究发现:（1）在JAR和JAR/VP16细胞中,JWA能调节VP16引起的线粒体损伤,从而引起一系列凋亡相关信号转导的发生;（2）JWA是VP16活化P38,JNK通路且与线粒体膜电位,Caspase-9活化密切相关的重要分子。JWA参与VP16诱导凋亡的信号通路可能为:VP16→JWA→MAPK家族（P38,JNK）→线粒体膜电位→Caspase-9→凋亡。（3）P-糖蛋白的表达可能受JWA的调节,通过JNK信号通路,影响转录因子c-Jun的活性,从而调节P-糖蛋白的表达。JWA参与调节P-糖蛋白的信号通路可能为:JWA→JNK→c-Jun→P-gp。

论文目录

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• 综述
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