论文摘要
研究背景：胶质母细胞瘤（glioblastoma GB）是大脑最好发的，恶性程度最高的星形细胞肿瘤，大约占颅内肿瘤的12～15％。临床上患者以肿瘤反复复发和快速死亡为特征，单次手术切除后患者中位生存期仅为17周；手术联合放化疗治疗，也不能使GB患者的中位生存期达到1年，多数患者仍然死于GB的复发，因此迫切需要寻找新的治疗方法。肿瘤干细胞（cancer stem cells CSCs）是恶性肿瘤内极少量的种子细胞，也是导致肿瘤耐药、高致死率和高复发率的关键因素。CSCs具有无限自我更新、无限增殖、多向分化的潜能。诱导分化治疗正是利用CSCs具有多向分化的特点，应用安全无毒的药物诱导CSCs向正常组织细胞分化，降低其致瘤性；促进CSCs从静止状态分化进入分裂期，增强肿瘤细胞对化学药物的敏感性，消除其耐药性，并不损伤周围正常组织。这是近20年来肿瘤治疗的重大突破，已应用于血液肿瘤的临床治疗。但在GB等实体肿瘤的治疗领域始终没有突破性进展，其主要原因是尚没有长效而无毒的药品可以应用。骨形成蛋白（bone morphogenetic protein BMP）属于TGF-β家族，是结构类似的高度保守的功能蛋白质族，已发现有40多个成员，相对分子量在28-30kDa，广泛分布于人体多种组织和细胞，具有多重功能。其重要成员BMP2是使神经祖细胞从神经发生向胶质发生转化的重要开关。体外实验证实，BMP2能改变神经干细胞（neural stem cells NSCs）的分化方向，诱导端脑的NSCs向星形胶质细胞分化。近年来，BMP2介导的生长调节作用被广泛研究于肿瘤中，这些功能多种多样。但BMP2是否能够促进GB干细胞（glioblastoma stem cells GSCs）的分化，影响GB的恶性生物学特征及其分子机制还不清楚；另外需要深入研究BMP2是否有望应用于临床GB的综合治疗中，这些研究可能会为GB的治疗带来新的希望。研究目的：本研究旨在应用rhBMP2蛋白诱导GSCs分化为成熟的胶质细胞；通过诱导分化的方法，以期改良其恶性生物学行为；进行60Co-γ射线辐照联合rhBMP2，模拟放疗联合诱导分化的临床综合治疗的体外环境，观察rhBMP2对肿瘤细胞的放疗敏感性的影响；初步研究rhBMP2发挥作用的分子机制，为GB的分化治疗提供理论依据。研究方法：1、GB组织的原代培养和胶质瘤U251细胞系筛选，获得GSCs，进行GSCs克隆球的培养和鉴定。2、用rhBMP2蛋白干预GSCs，观察分化后的细胞中，胶质细胞标志蛋白GFAP的表达状况；观察rhBMP2促进GSCs分化后，细胞的增殖和自我更新能力的变化；分析rhBMP2发挥作用的可能机制。3、用不同剂量60Co-γ射线辐照联合rhBMP2干预，模拟临床综合治疗的体外环境，观察联合处理对GSCs分化的影响；通过细胞周期和克隆形成能力的检测，分析rhBMP2促进GSCs分化对60Co-γ射线刺激敏感性的影响。研究结果：1、成功筛选并培养人胶质瘤U251细胞系的干细胞克隆球，建立了胶质瘤细胞系干细胞培养简单易行的新方法。与传统方法不用，我们应用细胞培养技术，根据细胞的不同生长状态，将悬浮细胞收集起来，培养于添加了生长因子的神经干细胞培养基内，进行条件性培养，最终形成GSC克隆球。我们通过增殖实验、自我更新实验、细胞周期测定和干细胞表面标志蛋白及相关基因的检测，证实了GSC克隆球的干细胞身份。2、rhBMP2蛋白可能通过抑制EZH2的活性促进GSCs分化，降低肿瘤细胞的增殖能力和自我更新能力。我们用rhBMP2蛋白干预GSCs，通过免疫印迹实验发现，rhBMP2干预能够促进分化细胞内GFAP蛋白的表达水平升高；通过免疫荧光实验发现，rhBMP2干预后，细胞浆内GFAP蛋白表达量增多，且呈细丝状结构分布；克隆球更容易贴壁分化。同时干细胞相关基因Sox-2mRNA水平降低，这些结果说明rhBMP2能促进GSCs分化；通过流式细胞技术检测细胞凋亡，证实rhBMP2不影响细胞的凋亡，因此认为rhBMP2无毒性作用。我们通过对分化细胞的增殖能力和克隆形成能力检测，明确了rhBMP2通过促进GSCs分化，降低肿瘤细胞增殖和自我更新能力。通过检测与干细胞分化相关的信号通路中部分关键蛋白（EZH2、Smad4、Wnt5a、β-catenin）的表达水平，提示rhBMP2可能通过抑制EZH2的活性发挥促进GSCs分化的作用。3、60Co-γ射线辐照联合rhBMP2干预，能够高效的促进GSCs细胞向成熟胶质细胞分化，从而增强GSCs对60Co-γ射线辐照的敏感性，降低辐照后肿瘤细胞的自我更新能力。高剂量（20gy）或低剂量（0.25gy）60Co-γ射线辐照联合rhBMP2干预，细胞内GFAP蛋白表达量均明显升高，而且在细胞浆呈细丝状结构分布。我们进行细胞周期测定发现，rhBMP能够促进60Co-γ射线辐照后，细胞由G0/G1期向S期进展，说明，60Co-γ射线辐照联合rhBMP2，能够促进GSCs由静止状态转向增殖状态。提示，rhBMP2能够增强GSCs对放疗的敏感性。平板克隆形成实验的结果显示，高剂量（20gy）或低剂量（0.25gy）60Co-γ射线辐照联合rhBMP2，均能够有效降低辐照后肿瘤细胞的克隆形成能力，因此推测，rhBMP2能够降低放射治疗后GB的复发。结论：本研究中，我们建立了胶质瘤细胞系干细胞培养简单易行的新方法，成功筛选并培养人胶质瘤U251细胞系的干细胞克隆球。研究了rhBMP2蛋白对GSCs促进分化的作用，以及对肿瘤细胞恶性生物学特征的影响。首次模拟临床综合治疗的体外环境，应用不同剂量60Co-γ射线辐照联合rhBMP2处理，研究其对辐照后GSCs分化的影响，发现rhBMP2不仅能增强GSCs对放疗的敏感性，还能够降低放疗后GB的复发。
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标签：重组人骨形成蛋白论文; 胶质母细胞瘤论文; 胶母干细胞论文;