CCR7的表达及与配体CCL19对鼠小胶质细胞生物学功能的影响

论文摘要

趋化因子与表达于细胞表面的受体共同作用发挥其生物学功能。趋化因子受体均为G蛋白偶联受体，与趋化因子结合后，通过G蛋白变构而使受体磷酸化，进行信号转导。CCR7是由EBV诱导后发现的基因，被认为是EBV在B淋巴细胞上作用的调节因子。CCR7受体表达于各种淋巴组织，并激活T、B淋巴细胞。作为免疫系统中一个重要的归巢受体，CCR7不仅控制B细胞和T细胞归巢、DCs穿过高内皮静脉，而且还能把它们正确定位在外周淋巴器官的T、B细胞区。CCR7可能对趋化成熟DCs进入淋巴管非常重要。SLC是由淋巴管内皮细胞产生的，从淋巴管，DCs回流到本地LN，最终定位于T细胞区。这一最后定位过程可能被ELC控制，因为ELC被定居在此的成熟DCs产生。在免疫刺激或炎症刺激后，DCs从外周组织迁移到淋巴器官，提呈抗原。在此过程中由非成熟DCs转变为成熟DCs，在成熟过程中下调两个CC趋化因子受体：CCR1、CCR5，对其配体（HCC-1，MIP-1β）的趋化活性消失，但上调CCR7表达。对呈现在炎症位点或免疫位点的趋化因子的反应的抑制使其离开外周组织，对SLC、ELC的反应引导其定位到淋巴器官。由于CCR7重要性，研究者在不同的细胞对这一趋化因子受体进行大量研究，然而到目前为止，还没有关于小胶质细胞中CCR7表达情况的研究。近年来发现，CCL21与其中一个CXCR3互作诱导小胶质细胞的趋化。进一步研究发现，在CNS中这一信号系统不可能发挥重要作用。本试验用3d内gcd-10野生型小鼠作为实验材料，首次采用RT-PCR和Western blotting方法，发现活化的小胶质细胞表达CCR7，然而在静息状态下并不表达。LPS活化的原代小胶质细胞CCR7的表达量随时间和LPS处理剂量的变化而变化。同时，我们还发现Cell Debris处理的小胶质细胞中也有CCR7的表达，而IFN-γ激活的小胶质细胞并不表达。TGF-β1与多种细胞因子的产生有关：TGF-β1能抑制各种细胞因子的表达。本试验使用TGF-β1处理LPS活化的小胶质细胞发现，TGF-β1可明显抑制CCR7 mRNA的表达。本试验还使用了PI3K、MEK／ERK和p38信号通路的阻断剂LY294002、U0126和SB203580处理原代培养的小胶质细胞，结果没有检测到LY294002或SB203580影响CCR7 mRNA的表达，U0126上调CCR7的表达。本试验还检测了LPS处理的小胶质细胞TNF-α和iNOS mRNA表达。LPS活化的小胶质细胞表达前炎症因子TNF-α和iNOS mRNA，且TNF-αmRNA的表达早于iNOS mRNA。LPS处理6h，TNF-αmRNA在所选取的处理时间表达量最高，24h的表达量与处理前的表达水平相当；iNOS的表达峰值出现在LPS处理6h，并且直到24h iNOS mRNA仍然维持高水平表达活化的小胶质细胞表达CCR7促使我们研究该受体与其配体CCL19对细胞生物学功能的影响。结果表明，LPS处理的小胶质细胞的死亡率约为20％，当加入CCL19后，细胞死亡率降低到10％左右，提示CCL19能减少约50％LPS处理的小胶质细胞死亡率，因此CCL19与其受体作用可以降低细胞的死亡率。我们还发现，在LPS处理的小胶质细胞中加入CCL19后，可显著提高细胞的吞噬作用和胞内Ca2+浓度。结论：LPS或Cell Debris活化的小胶质细胞表达CCR7，而处于静息状态的小胶质细胞并不表达该趋化因子受体；CCR7的配体MIP-3β可提高LPS处理的小胶质细胞的存活率、吞噬作用以及胞内Ca2+浓度。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 小胶质细胞的研究进展
• 1 小胶质细胞的形态与分类
• 2 小胶质细胞的活化
• 2.1 活化小胶质细胞形态和功能的变化
• 2.2 小胶质细胞活化过程中的信号传导
• 2.3 小胶质细胞活化的分子机制
• 3 小胶质细胞的功能
• 3.1 小胶质细胞的吞噬作用
• 3.2 小胶质细胞的免疫特性
• 3.3 小胶质细胞的功能:双刃剑
• 4 小胶质细胞功能的细胞因子调节
• 5 小胶质细胞与中枢神经系统疾病
• 参考文献
• 第二章 趋化因子及其受体的研究进展
• 1 趋化因子及其受体的结构和分类
• 2 趋化因子及其受体的编码基因
• 3 趋化因子及其受体的来源、产生和调节
• 3.1 趋化因子及其受体的来源和产生
• 3.2 趋化因子及其受体产生的调节
• 4 趋化因子及其受体的生物学功能
• 5 趋化因子及其受体的检测方法
• 6 趋化因子及其受体与疾病
• 参考文献
• 第二部分 研究内容
• 第一章 小胶质细胞的培养、分离、纯化和鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 实验动物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化
• 1.2.3 免疫细胞化学鉴定
• 2 结果
• 2.1 原代培养的小胶质细胞
• 2.2 原代小胶质细胞的鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 活化的小胶质细胞表达CC趋化因子受体7
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 实验动物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化
• 1.2.3 小胶质细胞的分组处理
• 1.2.4 RT-PCR
• 1.2.5 Western blotting检测
• （1） 蛋白质的提取
• （2） 细胞蛋白质的测定
• （3） SDS-PAGE
• （4） 免疫印迹显色
• 1.3 图像分析
• 1.4 数据处理
• 2 结果
• 2.1 小胶质细胞表达CCR7随LPS干预时间的变化
• 2.2 检测小胶质细胞表达CCR7 mRNA随LPS干预浓度的变化
• 2.3 Cell Debris对小胶质细胞表达CCR7和CXCR3 mRNA的影响
• 2.4 LPS和IFN-γ对小胶质细胞CCR7和CXCR3 mRNA的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 TGF-β1抑制LPS诱导小胶质细胞CCR7 mRNA的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 实验动物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化
• 1.2.3 小胶质细胞的分组处理
• 1.2.4 RT-PCR
• 1.3 图像分析
• 1.4 数据处理
• 2 结果
• 2.1 U0126和SB203580对LPS诱导小胶质细胞CCR7 mRNA表达的影响
• 2.2 LY294002对LPS诱导小胶质细胞CCR7 mRNA表达的影响
• 2.3 TGF-β1对LPS诱导小胶质细胞CCR7 mRNA表达的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 活化小胶质细胞炎症相关因子mRNA的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 实验动物
• 1.1.4 细胞株
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化
• 1.2.3 小胶质细胞的分组处理
• 1.2.4 RT-PCR
• 1.3 图像分析
• 1.4 数据处理
• 2 结果
• 2.1 LPS对原代小胶质细胞表达TNF-α和iNOS mRNA的影响
• 2.2 HAPI cells表达TNF-α和iNOS mRNA随LPS干预时间的变化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 CCR7与配体CCL19对小胶质细胞生物学功能的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.1.3 实验动物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化
• 1.2.3 Cell survival assay
• 1.2.4 Phagocytosis assay
• 2+浓度测定'>1.2.5 细胞内Ca²⁺浓度测定
• 1.3 数据处理
• 2 结果
• 2.1 CCL19提高LPS处理小胶质细胞的存活率
• 2.2 CCL19对LPS处理小胶质细胞吞噬作用的影响
• 2+浓度的影响'>2.3 CCL19对LPS处理小胶质细胞内Ca²⁺浓度的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 附录1
• 附录2