青霉素G多克隆抗体的制备及其快速检测方法的初步研究

论文摘要

本研究使用碳二亚胺法（EDC）和生理学法（青霉素化反应）两种偶联方法将青霉素G与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联,合成2种免疫抗原PEN-EDC-BSA、PEN-BSA,2种检测抗原PEN-EDC-OVA、PEN-OVA,经SDS-PAGE实验证明青霉素G与载体蛋白偶联成功,通过测定载体蛋白、青霉素G以及合成抗原280nm和260nm处的OD值,计算出合成抗原PEN-EDC-BSA、PEN-EDC-OVA、PEN-BSA、PEN-OVA中青霉素G与载体蛋白的结合比分别为12:1、16:1、6:1、7:1。实验兔子分为E、S两组,分别用PEN-EDC-BSA、PEN-BSA免疫,制备抗血清,利用间接ELISA法测定抗血清效价,E组效价在1:1600-1:12800之间,S组效价在1:102400-1:204900之间。应用辛酸-硫酸铵法提纯IgG,测定提纯后IgG溶液浓度在27.42-18.15mg/ml之间,且其效价基本上无改变,综合IgG溶液的浓度和效价两个指标,筛选出最佳IgG溶液为S3、S4,其浓度与效价分别为23.97、24.27mg/ml和1:102400、1:204900。将SPA稳定液与不同浓度的IgG混合,制备SPA工作液,再与检测抗原反应,筛选出SPA菌稳定液和IgG最佳比例为2:1,最佳菌体工作浓度为2%。应用SPA-COA快速检测牛奶中抗生素残留的检测限度为10μg/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 青霉素类抗生素的理化特性
• 1.2 青霉素类抗生素的抗菌机理
• 1.3 抗生素残留
• 1.4 抗生素残留的危害
• 1.4.1 过敏反应
• 1.4.2 耐药菌株的产生
• 1.4.3 破坏肠道菌群
• 1.4.4 对乳制品生产的影响
• 1.4.5 其它毒害作用
• 1.5 抗生素残留产生原因
• 1.6 抗生素残留检测方法
• 1.6.1 微生物检测法
• 1.6.2 理化检测法
• 1.6.3 免疫分析技术
• 1.7 立题依据
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验药品
• 2.1.2 实验动物及饲养
• 2.1.3 实验主要仪器
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 实验内容
• 2.2.1 青霉素结合抗原的合成
• 2.2.2 SDS-PAGE 法鉴定结合抗原的偶联效果
• 2.2.3 青霉素G 合成抗原浓度的测定
• 2.2.4 偶联物中载体蛋白与半抗原结合比的测定
• 2.2.5 青霉素G 多克隆抗血清制备
• 2.2.6 琼脂双向免疫扩散法测定青霉素G 抗血清效价
• 2.2.7 间接ELISA 法测定青霉素G 抗血清效价
• 2.2.8 采血及血清的分离
• 2.2.9 抗血清的纯化与鉴定
• 2.2.10 SPA-COA 检测牛奶中青霉素 G 残留
• 3 试验结果
• 3.1 青霉素结合抗原的鉴定
• 3.1.1 结合抗原偶联效果
• 3.1.2 合成抗原的浓度
• 3.1.3 结合比的计算
• 3.2 抗青霉素血清的效价测定
• 3.2.1 琼脂双向免疫扩散实验
• 3.2.2 PEN-EDC-OVA、PEN-OVA 最佳包被浓度的确定
• 3.2.3 间接ELISA 法测定抗血清效价
• 3.3 IgG 的纯化与鉴定
• 3.3.1 IgG 纯度鉴定
• 3.3.2 IgG 效价测定
• 3.3.3 IgG 浓度的测定
• 3.3.4 最佳IgG 溶液的筛选
• 3.4 SPA-COA 测定牛奶中青霉素 G 残留
• 3.4.1 SPA-COA 最佳试验条件
• 3.4.2 应用 SPA-COA 快速牛奶中青霉素 G 的初步研究结果
• 4 讨论
• 4.1 青霉素结合抗原
• 4.1.1 抗原合成
• 4.1.2 结合比
• 4.2 免疫剂量、免疫途径及免疫程序
• 4.3 抗血清的制备
• 4.4 抗血清效价测定
• 4.5 抗体纯化
• 4.6 SPA-COA 检测牛奶中青霉素 G 残留
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介