肠出血性大肠杆菌O157：H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

论文摘要

利用高效表达EHEC O157 主要保护性抗原紧密素和志贺毒素Stx1、Stx2 融合蛋白的工程菌株,制备以包涵体形式表达的融合蛋白, 蛋白采用SDS-PAGE 凝胶分离、电洗脱法纯化。将纯化的融合蛋白Eae-Stx1/2B 免疫BALB/c 小鼠,常规方法细胞融合,间接ELISA 法筛选,获得3 株阳性杂交瘤细胞株。三株单抗1G2、3C6、1B10纯化的腹水ELISA 测定效价分别为1:6.4×106、1:1.2×107、1:3.2×104。Western-blot 分析表明三株单抗与融合蛋白可发生特异性反应。间接ELISA 分析表明,三株单抗均能与EHEC O157 国际标准菌株EDL933 反应,而与不产生紧密素和志贺毒素的EHEC O157 基因缺失突变株不反应,证明三株单抗是特异性抗肠出血性大肠杆菌EHEC O157 主要保护性抗原紧密素和志贺毒素stx1、stx2 的单克隆抗体。实验还对EHEC O157 EDL933 菌株细菌培养上清、细胞周质中的志贺毒素和外膜蛋白中的紧密素进行简单的提取,并用制备的单克隆抗体对其检测分析。

论文目录

前言

第一篇文献综述

第一章 EHEC O157 主要致病因子

1 LEE 致病岛

2 志贺毒素

3 p0157 质粒

第二章 EHEC O157 主要保护性抗原与免疫预防

1 多糖-蛋白结合菌苗

2 Stx 类毒素/亚单位菌苗

3 重组活菌苗载体

4 减毒活菌苗

5 转基因植物疫苗

6 粘膜免疫

7 抗O157 单克隆抗体

第二篇实验研究

第一章 EHEC O157 主要保护性抗原重组融合蛋白的制备和纯化

1 材料与方法

2 结果

2.1 纯化融合蛋白浓度测定

2.2 纯化融合蛋白的SDS-PAGE 电泳分析

3 讨论

4 小结

第二章 EHEC O157 主要保护性抗原单克隆抗体的制备和鉴定

1 材料与方法

2 结果

2.1 动物免疫和抗体间接ELISA 检测方法的建立

2.2 阳性杂交瘤细胞系的建立

2.3 腹水的制备和纯化

2.4 阳性杂交瘤细胞培养上清及腹水效价

2.5 单克隆抗体亚类鉴定

2.6 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性

2.7 Western-blot 鉴定单抗识别抗原特异性

3 讨论

3.1 抗原的选择和动物免疫

3.2 选择高质量的胎牛血清

3.3 骨髓瘤细胞的筛选

3.4 细胞融合和克隆

4 小结

第三章单克隆抗体检测EHEC O157 的研究

1 材料与方法

2 结果

2.1 EHEC O157中stx基因的PCR鉴定

2.2 单抗对EHEC O157 的初步检测

2.3 单抗对EHEC O157 的检出限

2.4 EHEC O157 细菌培养上清中志贺毒素的检测

2.5 EHEC O157 细胞周质中志贺毒素的提取和检测

2.6 EHEC O157 外膜蛋白的提取和检测

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

中文摘要

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