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中国沙棘体细胞胚胎的发生及BADH遗传转化拟南芥相关研究

2020-11-28阅读(1018)

中国沙棘体细胞胚胎的发生及BADH遗传转化拟南芥相关研究

论文摘要

中国沙棘（Hippophae rhamnoides L.subsp.sinensis Rousi）是广泛分布在欧亚大陆上,具有生态、医用、食用价值的多功能经济乔灌木;其优良苗木的繁殖因各种限制因素,难以满足市场的大量需求。近年来,又面临大面积死亡的现象,抗逆性不够被认为是根本原因,抗逆基因的转入可能是解决问题的最佳途径。中国沙棘体细胞胚胎发生体系的建立,既能提供大量优良苗木,又能为其转基因研究奠定基础。又由于中国沙棘被应用在食品、药品、饲料等生产领域中,抗逆性基因BADH作为目的基因与标记基因转入植物体内,可达到提高转化株的抗逆性及消除抗性标记的目的,意义重大。因此,本论文在前人有关研究的基础之上,通过2年的试验,成功建立了以中国沙棘以茎尖为材料通过间接途径诱导体细胞胚胎发生的再生体系,并对体细胞胚发生过程中的相关影响因素进行了探讨分析。在BADH遗传转化拟南芥（Arabidopsisthahana（Linn.）Heynh.）试验中,进行了其作为标记基因判断阳性植株的相关表型筛选依据的探索研究,为以后相关工作的开展提供坚实的背景资料。主要研究结果如下:1.以中国沙棘组培苗的茎尖为外植体,进行愈伤组织及胚性愈伤组织诱导试验,结果发现在1/4MS培养基上的愈伤组织发生率最高,对愈伤组织的诱导具有关键作用;而无论单独使用NAA还是2,4-D都不利于胚性愈伤组织的发生,所以在胚性愈伤组织诱导中,生长素与细胞分裂素的结合是必须的;同时得出结论:NAA与KT的结合能更有效的诱导胚性愈伤组织的发生。2.在中国沙棘愈伤组织及胚性愈伤组织诱导试验基础之上,深入探讨诱导中国沙棘胚性愈伤组织发生的影响因素。试验结果表明,以1/4MS+KT1.0mg/L+NAA0.3mg/L+琼脂粉6 5g/L+白砂糖30g/L为最适配方,愈伤组织诱导率达到90.10%,胚性愈伤组织诱导率达到77.67%,平均体细胞胚的发生数达到15.48。3.通过对中国沙棘子叶和下胚轴在诱导培养基上不同放置方式的研究发现,接种方式不同导致愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导效果不同。子叶的愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导率由高到低依次为:子叶切口向下>远轴面（背面）向下>近轴面（正面）向下;而下胚轴极性下端倾斜接触培养基比水平接触培养基更有利于愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导。4.通过将中国沙棘茎尖、子叶、下胚轴分别接种在诱导培养基上的试验发现:茎尖的诱导效果远远高于子叶和下胚轴,分别能达到90.10%的愈伤组织诱导率和77.67%的胚性愈伤组织诱导率;而子叶仅为66.73%和14.80%;下胚轴为52.80%和34.87%,均低于茎尖。所以,确定中国沙棘组培苗茎尖为最佳外植体。5.通过进行基本培养基和KT对中国沙棘体细胞胚植株再生的影响试验,结果发现:4种基本培养基WPM、MS、1/2MS、1/4MS中,WPM培养基促进效果最明显。在进一步通过降低糖含量及调整细胞分裂素KT浓度的试验之后,确定中国沙棘体细胞胚植株再生的最佳配方为:WPM+KT0.05mg/L+白砂糖20g/L+琼脂粉6.5g/L,植株再生率达到60.30%。6.通过Trizol法提取菠菜RNA,用DNAMAN软件设计引物BH4.24.1:5’-CTCGCCTTACCCTCTCAACTC-3’和BH4.24.2:5’-CTGTAAACTCGACCTTCTCTGCG-3’,用RT-PCR法克隆到BADH基因片段,经测序证实BADH基因被成功克隆。7.在己从菠菜中克隆到的BADH基因序列上、下游分别添加酶切位点BglⅡ（识别位点:agatct）和PmlⅠ（识别位点:cacgtg）,成功构建pCAMBIA1305.2-BADH表达载体,并进行了野生型拟南芥的侵染转化试验。8.pCAMBIA1305.2-BADH表达载体上既含有BADH基因,又含有潮霉素抗性标记基因,可以用甜菜碱醛和潮霉素两种筛选介质来筛选转基因植株,起到互相验证转基因植株的作用。试验结果表明:在20mM甜菜碱醛（BA’）筛选剂选择压力下,没有筛选到转基因株系;在含25mg/L潮霉素的筛选培养基上,获得4个转基因株系（HBT0（1）、HBT0（2）、HBT0（3）、HBT0（4））,4个对照株系（HKT0（1）、HKT0（2）、HKT0（3）、HKT0（4））。9.将通过25mg/L潮霉素筛选到的含BADH基因的拟南芥株系（HBT0（1）、HBT0（2））,通过PCR分子检测,证实BADH基因已转入拟南芥基因组中;将收获的T1代种子在25mg/L潮霉素的培养基上筛选发现,转基因植株:非转基因植株的抗性筛选比率符合3:1的孟德尔遗传分离规律。10.含BADH基因的转基因株系（HBT0（1）、HBT0（2））的T1代阳性植株及成熟种子在含不同浓度NaCl的培养基上,经过一段时间光培养和暗培养处理,根和下胚轴的生长都受到不同程度的影响,表现出一定抗盐能力;尤其在阳性植株表型分析中,含BADH基因的转基因株系在100mM NaCl培养基上,抗逆性明显优于对照株系,说明转基因株系能耐受100mM盐的逆境胁迫。11.含BADH基因的转基因株系（HBT0（1）、HBT0（2））的T1代阳性植株及成熟种子在含20mM BA’的培养基上,经过一段时间光培养和暗培养处理,转基因株系的表型如根、下胚轴等形态指标比对照株系都有明显的伸长生长,表现出一定的抗逆性能;尤其在阳性植株表型分析中,含BADH基因的转基因株系与对照株系的表型差异仍表现在根的生长受到最明显的影响,与敏感性试验的结论一致,进一步验证了选用根的表型特征作为BADH基因筛选拟南芥转基因株系的筛选依据的可行性。另外,凭借根长表型为筛选判断依据进行试验时,发现以培养到15d左右为最合适判断时机,为BA’筛选转基因拟南芥提供了一定表型判断依据。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词
  • 目录
  • 第一篇 中国沙棘体细胞胚胎发生及植株再生体系的建立
  • 前言
  • 1 文献综述
  • 1.1 体细胞胚胎发生的研究现状
  • 1.1.1 体细胞胚胎的起源及发生方式
  • 1.1.2 体细胞胚发生的特点
  • 1.1.3 体细胞胚发生及形态建成的研究
  • 1.1.4 体细胞胚发生或建成的假说
  • 1.1.5 体细胞胚发生的影响因素
  • 1.1.5.1 内部因素
  • 1.1.5.2 外部因素
  • 1.1.6 体细胞胚胎发生的广泛应用
  • 1.2 林木体细胞胚的研究进展
  • 1.2.1 体细胞胚发生途径再生林木的情况
  • 1.2.2 林木体细胞胚发生体系的应用
  • 1.3 沙棘概况及应用研究价值
  • 1.3.1 沙棘的起源、分类及分布
  • 1.3.2 沙棘的应用价值
  • 1.3.2.1 沙棘的生态价值
  • 1.3.2.2 沙棘的食用价值
  • 1.3.2.3 沙棘的医疗价值
  • 1.3.2.4 沙棘的其它价值
  • 1.3.3 沙棘的大面积死亡问题
  • 1.4 沙棘繁殖技术研究现状
  • 1.4.1 有性繁殖
  • 1.4.2 无性繁殖
  • 1.4.2.1 组织培养繁殖方式
  • 1.4.2.2 其它无性繁殖方式
  • 2 本研究的目的及意义
  • 3 试验方法与内容
  • 3.1 试验材料与处理方法
  • 3.1.1 试验材料
  • 3.1.2 处理方法
  • 3.1.3 培养条件
  • 3.2 试验设计
  • 3.2.1 技术路线
  • 3.2.2 试验内容
  • 3.2.2.1 胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚胎发生
  • 3.2.2.2 体细胞胚胎发育及植株再生
  • 3.2.2.3 炼苗移栽
  • 3.3 试验结果的观测
  • 3.4 数据统计与分析
  • 4 试验结果与分析
  • 4.1 胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚胎的发生
  • 4.1.1 愈伤组织和胚性愈伤组织诱导
  • 4.1.1.1 愈伤组织和胚性愈伤组织诱导试验方案Ⅰ
  • 4.1.1.2 愈伤组织和胚性愈伤组织诱导试验方案Ⅱ
  • 4.1.2 胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎的发生
  • 4.1.3 外植体接种方式对愈伤组织及胚性愈伤组织诱导的影响
  • 4.1.4 外植体类型对愈伤组织及胚性愈伤组织诱导的影响
  • 4.2 体细胞胚发育及植株再生
  • 4.2.1 基本培养基和KT对中国沙棘体细胞胚植株再生的影响
  • 4.2.2 KT和白砂糖对中国沙棘体细胞胚植株再生的影响
  • 4.3 体细胞胚胎发生动态
  • 4.4 炼苗移栽
  • 5 结论
  • 6 讨论
  • 6.1 培养基中还原性氮的影响
  • 6.2 外源激素的影响
  • 6.3 培养基中糖的种类及浓度的影响
  • 6.4 不同外植体的影响
  • 7 创新点及进一步研究思路
  • 7.1 创新点
  • 7.2 进一步研究思路
  • 第二篇 BADH基因的克隆、转化拟南芥及其作为生物安全标记基因的探索研究
  • 前言
  • 1 文献综述
  • 1.1 转基因生物的安全性
  • 1.1.1 转基因食品安全性状况
  • 1.1.2 转基因生态安全性状况
  • 1.1.3 抗性标记基因的生物安全性问题
  • 1.2 标记基因研究概况
  • 1.2.1 传统的选择标记基因
  • 1.2.2 生物安全性标记基因
  • 1.2.2.1 与激素代谢相关的基因
  • 1.2.2.2 与氨基酸代谢相关的基因
  • 1.2.2.3 与糖类代谢相关的基因
  • 1.2.2.4 能解除化合物毒性或胁迫相关的基因
  • 1.2.2.5 能发出特定荧光物质的蛋白酶类
  • 1.2.2.6 利用颜色差异性筛选转化体的相关基因
  • 1.2.2.7 抗性标记基因的剔除技术
  • 1.2.3 标记基因的综合应用
  • 1.2.3.1 与组织或器官特异性启动子的结合应用
  • 1.2.3.2 与MAT载体系统的结合应用
  • 1.2.3.3 β-葡萄糖苷酸酶作为标记基因的综合应用
  • 1.2.4 生物安全标记基因发展前景
  • 1.3 抗逆性基因研究进展
  • 1.3.1 抗生物胁迫基因工程研究
  • 1.3.2 抗非生物胁迫基因工程研究
  • 1.4 BADH基因的研究概况
  • 1.4.1 基因的功能特性与抗逆机制
  • 1.4.1.1 甜菜碱的生理功能
  • 1.4.1.2 甜菜碱合成途径
  • 1.4.1.3 BADH的功能特性
  • 1.4.1.4 BADH与耐盐、抗旱机制的关系
  • 1.4.2 存在BADH基因的植物种类及相应克隆
  • 1.4.3 BADH作为抗逆目的基因的转化研究
  • 1.4.4 作为生物安全标记基因的研究进展
  • 2 本研究的目的及意义
  • 3 试验方法与内容
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 试验材料
  • 3.1.2 酶以及生化试剂
  • 3.2 主要仪器设备
  • 3.3 常用溶液配制
  • 3.3.1 培养基的配制
  • 3.3.2 试验试剂的配制
  • 3.4 试验方法
  • 3.4.1 菠菜BADH基因的cDNA克隆
  • 3.4.1.1 菠菜总RNA的提取
  • 3.4.1.2 从基因组中克隆目的基因
  • 3.4.1.3 PCR扩增产物的电泳、切胶回收并检测
  • 3.4.1.4 回收的PCR产物与T载体的连接
  • 3.4.1.5 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10
  • 3.4.1.6 重组质粒的抗生素筛选及单克隆菌落活化培养
  • 3.4.1.7 重组质粒的菌落PCR检测
  • 3.4.1.8 DNA序列测定与分析
  • 3.4.2 表达载体的构建
  • 3.4.2.1 酶切位点的分析
  • 3.4.2.2 BADH基因两端酶切位点的加入
  • 3.4.2.3 DNA质粒的提取
  • 3.4.2.4 质粒的酶切
  • 3.4.2.5 酶切产物的连接
  • 3.4.2.6 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Top10
  • 3.4.2.7 重组质粒的抗生素筛选及单克隆菌落活化培养
  • 3.4.2.8 重组质粒的菌落PCR检测
  • 3.4.2.9 BADH基因片段与表达载体连接的DNA序列测定与分析
  • 3.4.3 农杆菌介导拟南芥的转化
  • 3.4.3.1 待浸染拟南芥植株的培养
  • 3.4.3.2 农杆菌感受态的制备
  • 3.4.3.3 表达载体质粒转化农杆菌
  • 3.4.3.4 农杆菌浸染液的制备
  • 3.4.3.5 拟南芥花序浸染农杆菌及培养
  • 0代拟南芥转基因植株的筛选与PCR鉴定'>3.4.4 T0代拟南芥转基因植株的筛选与PCR鉴定
  • 3.4.4.1 野生型拟南芥对甜菜碱醛的敏感性试验
  • 0代种子筛选'>3.4.4.2 拟南芥T0代种子筛选
  • 0代转基因株系的PCR检测'>3.4.4.3 拟南芥T0代转基因株系的PCR检测
  • 1代拟南芥转基因株系的筛选及相关抗逆性研究'>3.4.5 T1代拟南芥转基因株系的筛选及相关抗逆性研究
  • 1代种子'>3.4.5.1 潮霉素筛选拟南芥T1代种子
  • 1代阳性植株及种子逆境处理下的表型分析试验'>3.4.5.2 拟南芥T1代阳性植株及种子逆境处理下的表型分析试验
  • 4 试验结果与分析
  • 4.1 菠菜BADH基因的cDNA克隆
  • 4.1.1 菠菜总RNA的提取
  • 4.1.2 从基因组中扩增基因的结果
  • 4.1.3 DNA序列测定与分析
  • 4.2 表达载体的构建
  • 4.2.1 表达载体的选择及酶切位点的分析
  • 4.2.2 加入酶切位点的BADH基因的克隆
  • 4.2.3 DNA测序结果
  • 4.2.4 DNA质粒的提取
  • 4.2.5 插入BADH基因的DNA片段与表达载体的连接、构建
  • 4.2.6 DNA测序结果
  • 4.3 农杆菌介导拟南芥的转化
  • 4.3.1 待浸染拟南芥植株的培养
  • 4.3.2 表达载体质粒转化农杆菌及重组质粒的PCR检测
  • 4.4 拟南芥转基因植株的筛选
  • 4.4.1 野生型拟南芥对甜菜碱醛的敏感性试验
  • 0代种子筛选与转基因株系的PCR鉴定'>4.4.2 拟南芥T0代种子筛选与转基因株系的PCR鉴定
  • 4.4.2.1 潮霉素筛选试验
  • 4.4.2.2 甜菜碱醛筛选试验
  • 4.4.2.3 移栽培养
  • 0代转基因植株的PCR检测'>4.4.2.4 拟南芥T0代转基因植株的PCR检测
  • 1代拟南芥转基因株系的筛选及相关抗逆性研究'>4.4.3 T1代拟南芥转基因株系的筛选及相关抗逆性研究
  • 1代种子'>4.4.3.1 潮霉素筛选拟南芥T1代种子
  • 4.4.3.2 转基因拟南芥表型变化分析及抗逆功能验证
  • 5 结论
  • 6 讨论
  • 6.1 抗性标记基因的生物安全性问题
  • 6.2 启动子对于BADH基因表达的影响
  • 6.3 叶绿体遗传转化的局限性及与试验相关的改进
  • 7 创新点及进一步研究思路
  • 7.1 创新点
  • 7.2 进一步研究思路
  • 图版Ⅰ
  • 图版Ⅱ
  • 参考文献
  • 个人简介
  • 导师简介
  • 致谢

    • 相关论文文献

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