多维色谱法分析毛白杨次生维管系统再生过程的蛋白质表达谱

论文摘要

木材的形成是一个非常复杂的生物学过程，是众多树木基因在维管形成层活动中有序表达的结果。其表达产物中，相对于mRNA而言，蛋白质更能体现基因的表达特性及其功能，直接参与生物学过程。因此，对维管形成层蛋白表达谱的深入研究将有助于揭示木材形成过程中的相关基因及其功能。 利用本课题组建立的能够模拟维管形成层细胞发生和分化连续过程的毛白杨（Populus tomentosa）次生维管再生系统，对再生过程中不同时期进行了高密度取样，并对各样品的总蛋白提取物进行多维色谱（等电聚焦色谱-反相色谱）分离，获得了不同再生时期的蛋白表达谱。结合再生组织的切片观察和表达谱的比对分析，在整个愈伤组织产生、细胞分化及维管形成层发生、次生韧皮部及木质部分化等木材形成过程中共发现了3292次蛋白质显著上调或下调事件。通过肽质量指纹PMF分析及数据检索，共获得724个非冗余目标蛋白。其中，参与细胞周期调节和细胞分裂的有28个，占3.9％；参与细胞骨架的有16个，占2.2％；参与细胞信号转导的有48个，占6.6％；参与转录及转录因子有33个，占4.6％；参与光合作用的只有6个，占0.8％；参与细胞壁合成及其它代谢过程的有109个，占15.1％；功能未知的有279个，占38.5％；其它类别的有205个，占28.3％。其中，一些功能未知基因在再生前期大量表达，说明可能参与了形成层的发生和分化。目前，公共数据库中已知的参与调控树木次生维管发育的基因并不多，因此这些功能未知基因很可能就是特异性参与树木次生维管发育的新发现基因。 同时对毛白杨整个维管形成层区（包括未成熟木质部和未成熟韧皮部）进行了二维色谱分析，共分离出1895个蛋白质组份。通过对整个维管形成层区样品等电点位于8.5-4.0之间的993个蛋白质组份进行PMF分析和数据库检索，共鉴定出340个非冗余目标蛋白。其中，参与细胞周期调节和细胞分裂的有7个，占2.1％；参与细胞骨架的有11个，占3.2％；参与细胞信号转导的有26个，占7.7％；参与转录及转录因子有12个，点3.5％；参与光合作用的有6个，占1.8％；参与细胞壁合成及其它代谢过程的有60个，占17.6％；功能未知的有117个，占34.4％；其它类别的有101个，占29.7％。目前，这是国内外获得的数量最多的杨树发育中木材蛋白质表达谱。与再生的次生维管样品相比，等电点位于8.5-4.0之间只有5.9％（59个）的蛋白组份存在2倍以上的差异。表明本论文所采用的毛白杨剥皮再生系统再生出的次生维管系统与自然状态下发育的次生维管系统并无明显差异。

论文目录

• 目录
• 正文图表目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 次生维管系统与木材形成
• 1.1.1 次生维管系统的概念
• 1.1.2 次生维管系统的生物学及经济价值
• 1.1.3 次生维管系统的结构
• 1.1.4 次生维管系统发育过程及调控
• 1.1.4.1 原形成层的形成和维持
• 1.1.4.2 维管束径向发育模式调控
• 1.1.4.3 初生分生组织与次生维管形成层区调控比较
• 1.1.4.4 细胞扩张／伸长及次生壁的形成
• 1.1.4.5 木质素的生物合成与沉积
• 1.1.4.6 细胞程序性死亡与木材形成
• 1.1.4.7 激素在次生维管系统发育调控过程中的作用
• 1.2 次生维管系统发育研究的实验系统
• 1.2.1 细胞培养系统
• 1.2.2 组织切片系统
• 1.2.3 激光显微切割系统
• 1.2.4 植株整体系统
• 1.2.5 创伤系统
• 1.3 次生维管系统的研究方法
• 1.3.1 基因组学研究方法及应用
• 1.3.1.1 遗传作图（Genetic Mapping）
• 1.3.1.2 单核苷酸多态性分析（Single Nueleotide Polymorphism,SNP）
• 1.3.1.3 荧光原位杂交（FISH）及DNA纤维-荧光原位杂交（Fiber-FISH）技术
• 1.3.1.4 限制性标志基因组扫描技术（Restriction Landmark Genomic Scanning,RLGS）
• 1.3.2 转录组学研究方法
• 1.3.2.1 EST比较分析
• 1.3.2.2 抑制性扣除杂交（Suppressive Subtractive Hybridization,SSH）
• 1.3.2.3 基因表达系列分析（Serial Analysis of Gene Expression,SAGE）
• 1.3.2.4 基于cDNA-AFLP技术的转录组分析
• 1.3.2.5 基于基因芯片的转录组分析
• 1.3.3 代谢组学研究方法
• 1.3.4 蛋白质组学研究方法
• 1.3.4.1 二维凝胶电泳（2-DE）在蛋白质组学分离工作中的位置
• 1.3.4.2 多维色谱在蛋白质组学分离工作中的应用与进展
• 1.3.4.3 其它蛋白质组学分离技术
• 1.3.4.4 质谱仪在蛋白质组学鉴定工作中的应用与进展
• 1.4 本研究的立论依据和研究意义
• 1.5 本研究论文的技术路线
• 第二章 材料和方法
• 2.1 毛白杨剥皮再生及取样
• 2.1.1 毛白杨植株选择
• 2.1.2 大面积剥皮创伤
• 2.1.3 再生样品的获取
• 2.1.4 再生过程的显微观察
• 2.2 再生样品蛋白质提取
• 2.2.1 样品总蛋白提取
• 2.2.1.1 低pH值法提取总蛋白
• 2.2.1.2 高pH值法提取总蛋白
• 2.2.1.3 正辛基葡萄苷溶解法提取总蛋白
• 2.2.1.4 膜蛋白提取法
• 2.2.2 总蛋白浓度测定
• 2.2.2.1 BCA法蛋白质浓度测定
• 2.2.2.2 Bradford法蛋白质浓度测定
• 2.2.3 总蛋白的二维电泳分析评价
• 2.2.3.1 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.3.2 考马斯亮兰染色
• 2.2.3.3 银染
• 2.3 总蛋白的二维色谱分离
• 2.3.1 总蛋白溶解
• 2.3.2 蛋白质溶液脱盐
• 2.3.3 蛋白质浓度测定
• 2.3.4 一维聚焦色谱分离
• 2.3.4.1 试剂准备
• 2.3.4.2 色谱条件
• 2.3.4.3 分析程序
• 2.3.5 二维反相色谱分离
• 2.3.5.1 流动相的准备
• 2.3.5.2 色谱条件
• 2.3.5.3 分析程序
• 2.4 再生过程的蛋白质表达分析
• 2.4.1 色谱图的转换
• 2.4.2 蛋白质表达的差异比较
• 2.4.3 差异蛋白的选取
• 2.5 蛋白质PMF鉴定
• 2.5.1 试剂配制
• 2.5.2 蛋白质样品的酶解
• 2.5.3 酶解产物脱盐
• 2.5.4 MALDI-TOF MS分析
• 2.5.5 MS结果的数据库检索
• 2.6 部分蛋白质编码基因转录本表达模式测定
• 2.6.1 总RNA提取
• 2.6.2 单链cDNA制备
• 2.6.3 定量PCR引物设计
• 2.6.4 定量PCR分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 毛白杨次生维管系统再生过程
• 3.2 植物材料总蛋白的提取
• 3.2.1 三种提取可溶性蛋白方法的比较
• 3.2.2 膜蛋白的提取
• 3.2.3 总蛋白的提取
• 3.3 总蛋白的分离
• 3.3.1 一维聚焦色谱（HPCF）的可靠性分析及样品分离
• 3.3.1.1 简单混合物的分离效果
• 3.3.1.2 毛白杨形成层区样品的分离效果
• 3.3.1.3 次生维管再生样品的分离
• 3.3.2 二维反相色谱（HPRP）的可靠性分析及样品分离
• 3.3.2.1 简单混合物的分离效果
• 3.3.2.2 毛白杨形成层区样品的分离效果
• 3.3.2.3 次生维管再生样品的分离
• 3.4 再生过程的蛋白质表达分析
• 3.5 差异蛋白的PMF鉴定
• 3.6 毛白杨形成层区蛋白质表达谱
• 3.7 部分蛋白质编码基因的MRNA表达模式分析
• 第四章 讨论
• 4.1 植物次生维管系统研究的实验体系
• 4.2 蛋白质样品制备方案
• 4.3 二维色谱系统的分离能力
• 4.4 与2-DE／MALDI TOF结果比较
• 4.5 PF2D／MALDITOF系统可靠性
• 4.6 次生维管系统再生过程中的差异蛋白
• 4.6.1 细胞周期和细胞分裂
• 4.6.2 细胞骨架与维管发育
• 4.6.3 信号转导在维管发育中的地位
• 4.6.4 转录因子与转录调控
• 4.6.5 细胞次生壁的形成
• 4.7 11个蛋白质编码基因转录水平的定量分析
• 4.7.1 WAK4蛋白编码基因
• 4.7.2 CIPK18蛋白编码基因
• 4.7.3 MYB114转录因子
• 4.7.4 14-3-3 like蛋白编码基因
• 4.7.5 几个未知功能基因
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附表
• 附表一
• 附表二
• 附表三