水牛类精原干细胞体外分离培养的初步研究

论文摘要

为优化水牛类精原干细胞的分离、培养体系,本研究对水牛A型精原细胞分离纯化方法,体外增殖的影响因素及其生物学特性进行了探讨。（1）对3-7月龄本地水牛生精上皮细胞类型进行了研究。结果发现,该时期的睾丸生精上皮主要存在三种类型细胞,即支持细胞、间质细胞和A型精原细胞。A型精原细胞存在于管腔基底膜处,细胞核大、着色较深。免疫组化染色的结果显示,水牛A型精原细胞表达Oct-4、c-kit、PGP9.5、THY-1和DBA分子标记蛋白。通过RT-PCR也检测到睾丸组织中有Oct-4、c-kit、PGP9.5和THY-1基因的表达。（2）对水牛生精上皮细胞的分离纯化方法进行了研究。结果发现,采用胶原酶、胰蛋白酶两步酶消化法消化曲精细管能成功得到大量的睾丸细胞,再通过差异贴壁法结合Percoll不连续密度梯度离心法可分离纯化睾丸支持细胞与A型精原细胞。其中支持细胞表达其特异性波形蛋白,可用饲养层制作。（3）对水牛A型精原细胞体外培养特征及类精原干细胞特性进行了研究。结果发现,A型精原细胞接种第2天后开始增殖,10-12天左右形成类精原干细胞克隆。克隆呈碱性磷酸酶染色阳性,表达Oct-4、c-kit、PGP9.5、THY-1精原干细胞特异性因子和牛生殖细胞特异表达的凝集素蛋白DBA。（4）探讨了不同浓度血清和GDNF对A型精原细胞体外增殖效果的影响。结果发现,随着血清浓度的增高,细胞增殖速度加快,形成的DBA阳性克隆数也增多,最适宜血清添加量为2.5%。GNDF对精原细胞分裂增殖和克隆形成数促进作用明显,并呈现一定剂量依赖关系,最适宜添加的剂量为40ng/mL。以上结果表明：（1）3-7月龄的本地水牛睾丸可以分离得到A型精原细胞；（2）水牛A型精原细胞能在体外增殖形成类精原干细胞克隆；（3）在培养液中添加适量的血清和GDNF能促进水牛A型精原细胞的增殖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 縮略词（中英文对照表）
• 第一章 哺乳动物精原干细胞的研究进展（综述部分）
• 引言
• 一、精原干细胞的起源与精子发生
• 1.1 精原干细胞的起源
• 1.2 生精周期
• 1.3 精子发生
• 二、精原干细胞的生物学特性
• 2.1 精原干细胞的形态学特征
• 2.2 精原干细胞的分子标记
• 2.3 精原干细胞生长的微环境
• 2.4 精原干细胞生长的自我更新和分化
• 三、精原干细胞体外分离培养的研究进展
• 3.1 精原干细胞的分离纯化
• 3.2 精原干细胞的增殖影响因素
• 3.3 精原干细胞增殖分化的调控机制
• 四、精原干细胞的应用前景
• 4.1 研究精子的发生机制
• 4.2 生产转基因动物
• 4.3 保护珍稀物种
• 4.4 在医学领域的应用
• 五、本实验研究目的意义
• 第二章 水牛类精原干细胞体外分离培养的初步研究
• 第一节 水牛生精上皮细胞类型检测及A型精原细胞的分离纯化研究
• 摘要
• 1.1 材料与方法
• 1.2 试验结果
• 1.3 分析与讨论
• 1.4 结论
• 第二节 水牛A型精原细胞体外增殖培养行为
• 摘要
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 分析与讨论
• 2.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录