Notch1真核表达载体的构建及其对食管鳞癌Eca109细胞凋亡的影响

论文摘要

背景与目的:食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内其发病率目前位于恶性肿瘤的第六位,而在中国则位于第四位,食管癌的病理类型主要是鳞状细胞癌和腺癌。在我国主要以食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）为主,约占病例总数的90%以上。我国是食管癌发病率最高的国家之一,世界上70%的食管癌病例发生在我国。对于肿瘤的治疗,目前所用的手段如手术切除、化学药物疗法、放射治疗尚不完善,还有待于在治疗措施的基础研究上有所突破。目前,针对食管癌的基因治疗的途径很多,其中基因矫正和诱导凋亡是重要的两个方面,特别是细胞凋亡过程的研究已经越来越受到重视。Notch蛋白是一个进化上保守的跨膜受体家族,广泛分布和表达在多个物种之中。研究发现Notch1作为一条信号转导途径,不仅对正常组织、细胞的分化、发育起重要作用,而且和一些肿瘤的发生和生长相关,有学者发现Notch1在许多实体瘤中异常表达,如:如宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、神经母细胞瘤等。因此Notch1作为一种预防和治疗肿瘤的新途径越来越受到人们的重视。然而,Notch1与食管鳞癌的发生之间的关系,却少有报道,尤其是对食管鳞癌细胞凋亡之间的关系尚不清楚。基于此,通过本实验1、构建Notch1真核表达载体;2、观察Notch1基因转染Eca109细胞后对细胞凋亡的影响。旨在讨论Notch1对食管鳞癌Eca109细胞凋亡的影响,为进一步探讨Notch1在食管鳞癌发生中的作用提供理论依据,并为进一步研究Notch1基因治疗食管癌的可行性打下实验基础。方法:1.构建Notch1基因的真核表达载体:将Notch1插入真核表达载体pcDNA3.1（+）的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-Notch1。通过Trizol一步法从人胎盘组织中提取总RNA,反转录合成cDNA,目的片断连入T载体后经PCR、双酶切及序列鉴定等方法保证了插入真核表达载体pcDNA3.1（+）序列的正确性。并对重组真核表达载体pcDNA3.1（+）-Notch1进行PCR、双酶切鉴定,证实构建成功。2.观察Notch1基因转染Eca109细胞后对细胞凋亡的影响。将Notch1基因体外转染Eca109细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察,并进一步通过流式细胞仪法收集转染后24h、48h、72h的细胞,检测细胞凋亡情况。结果:1.酶切分析和DNA测序表明:目标序列准确插入载体,pcDNA3.1（+）-Notch1基因真核表达载体构建成功。2.Notch1真核表达载体转染Eca109细胞通过倒置显微镜进行形态学观察:结果显示转染Notch1的24h、48h、72h后Eca109细胞在24小时细胞基本没变化,从48h开始细胞逐渐开始凋亡,到72h可见细胞凋亡明显增多,提示外源性Notch1片段的引入能引起Eca109细胞凋亡。3.转染pcDNA3.1（+）-Notch1载体的Eca109细胞通过Annexin V-FITC法检测早期凋亡细胞在24h、48h、72h的凋亡率分别为20.57%、21.50%、38.03%;未转染组在24h、48h、72h的凋亡率分别为4.40%、5.57%、8.80%;转染空载体组在24h、48h、72h的凋亡率分别为3.88%、6.26%、8.55%。转染pcDNA3.1（+）-Notch1载体的Eca109细胞组与未转染的Eca109细胞组及转染空载体组相比凋亡率明显增高,差异具有统计学意义（p＜0.05）。结论:1.成功构建了真核表达载体,并命名为pcDNA3.1（+）-Notch1。2.Notch1基因高表达对食管鳞癌Eca109细胞有明显的促凋亡作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 Notch1真核表达载体的构建及其对食管鳞癌Eca109细胞凋亡的影响
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 Notch1信号途径与肿瘤的关系
• 参考文献
• 缩略词
• 攻读硕士期间发表论文情况
• 致谢